CCNB1基因在口腔鱗狀細胞癌中的表達及意義

崔宇平 馬洪 段曉峰 孫昆俊

口腔癌是世界第六大癌癥，全球平均每年臨床上確診的發(fā)病人數(shù)約500 000 人，癌癥晚期的患者存活率低(5 年生存率大約10%～30%)[1-2]，在我國， 每10 萬名癌癥患者中罹患口腔癌疾病率為男性8.7/10 萬， 女性6.0/10 萬，相關研究表明，口腔癌的發(fā)生與發(fā)展是多基因疾病、環(huán)境及遺傳因素共同參與的結果[3-7]。近年來相關臨床研究表明，細胞周期蛋白B1(cyclin B1,CCNB1)基因在乳腺癌、卵巢癌、直腸癌等多種腫瘤組織中高表達。本次研究通過Real Time PCR技術檢測CCNB1 mRNA分別在正常口腔黏膜組織及口腔鱗狀細胞癌(OSCC)中的表達情況，并比較其在OSCC中不同的臨床特征是否有表達差異，為OSCC的早期發(fā)現(xiàn)及診斷提供相關依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織標本

標本來自貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院及貴州省腫瘤醫(yī)院口腔頜面外科手術切除的新鮮組織(患者年齡≥18 歲)，患者術前檢查均無全身系統(tǒng)性疾病;正?？谇火つそM織取自拔牙患者;所有42 例OSCC組織及17 例正常組織,離體后立即用RNA later液暫封, 4 ℃冰箱過夜，-80°C冰箱保存。收集時間 2016-06～2017-01。

1.2 引物合成

根據(jù)參考文獻確定內參基因序列及引物[8]。CCNB1，上游序列：catggtgcactttcctcctt；下游序列：aggtaatgttgtagagttggtgtcc。內參基因GAPDH，上游序列：cttagcacccctggccaag；下游序列:gatgttctggagagccccg。

1.3 主要試劑及Real-time PCR技術

切取2～3 mm3大小組織, 利用Dynabeads?Rm-RNA DIRECTTM試劑盒(Roche公司,美國)， 使用磁珠法提取組織中mRNA, 用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(Roche公司)逆轉錄成cDNA(-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。再用LightCycler?R480 SYBR Green I Master(Roche公司)進行擴增,采用10 μl反應 體系: SYBR Green I Master 5 μl, 上下游引物4.0 μl, 模板1 μl。反應條件為:預變性95 ℃, 1 min;變性95 ℃, 10 s; 退火65 ℃, 30 s, 共64 個循環(huán)。每個樣品7 個復孔,取CT平均值,采用 2-ΔΔCT法進行結果分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

檢測結果結合臨床資料數(shù)據(jù), 應用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計學分析,P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

結果表明, 42 例OSCC及17 例口腔正常黏膜組織相對表達量分別為: (1.336 0±0.675 9), (0.035 9±0.023 8),t=12.446,P<0.05。其中OSCC組織中,不同臨床特征間比較結果(表 1)所示，CCNB1 mRNA擴增曲線為比較經典的S型(圖 1)，大約在21 個循環(huán)后進入熒光信號指數(shù)擴增階段， 大約擴增12 個循環(huán)以后進入平臺期，從擴增曲線我們可以了解到，CCNB1的CT值平均為21左右，CCNB1 mRNA溶解曲線為一個單峰(圖 2)，此單峰前后均未見其它的峰值，均可說明在實驗過程中未見因實驗操作不當可能引起的污染。

表 1 CCNB1 mRNA在OSCC中不同臨床特征的相對表達量

Tab 1 The relative expression of CCNB1 mRNA in OSCC different clinical features

臨床特征nCCNB1 mRNA相對表達量t值P值性別 男181.496 1±0.656 41.3420.187 女241.216 0±0.678 9年齡(歲) <60201.322 7±0.721 30.1210.905 ≥60221.348 2±0.648 8分化狀態(tài) 高分化271.139 1±0.691 82.7250.009 中、低分化151.690 5±0.489 7臨床分期 Ⅰ Ⅱ241.018 7±0.645 24.1500.000 Ⅲ Ⅳ181.759 1±0.455 0

注：P<0.05有統(tǒng)計學意義

圖 1 CCNB1 RT-PCR擴增曲線

圖 2 CCNB1 RT-PCR溶解曲線

3 討 論

細胞周期蛋白首先在海膽受精卵中被發(fā)現(xiàn)，在Howard學說中，細胞周期的各個分期是以細胞核DNA的復制和分裂作為標準，分成G1期(合成前期)、S期(合成期)、G2期(合成后期)、M期(分裂期)，根據(jù)細胞形態(tài)，從細胞的G1～G2期均為細胞間期，細胞周期蛋白在有絲分裂的細胞間期開始進行合成，其含量在G2/M期含量達到峰值，隨后含量逐漸減低直至下一輪細胞周期開始進行重復，不同類型的細胞周期蛋白與相對應的細胞周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)互相作用，進而促進細胞的增殖與發(fā)展。

CCNB1是細胞周期蛋白(cyclin)家族成員之一，該基因的長度大約8 800 bp，其作用于真核細胞有絲分裂周期中的G2/M檢測點，CCNB1是CDC2蛋白(cell division cycle 2)的伴侶分子，隨著CCNB1的含量與活性的增高，CDC2也會隨之增高，CCNB1與CDC2互相結合形成M期促進因子(M phase-promoting factor， MPF)，使細胞從細胞間期向M期進行轉變并開始有絲分裂，進而促進真核細胞周期的發(fā)展[9]，當細胞進入分裂期中期以后，后期促進復合物(anaphase promoting complex，APC)將泛素與CCNB1相連接，這時蛋白酶體(proteasome)將發(fā)揮作用，對結合泛素的CCNB1進行識別然后對其進行降解，進一步使MPF失活[10]，當MPF失活以后也就意味著M期的結束，一個完整的細胞周期完成，當CCNB1表達失調時，例如本次研究結果所示，在OSCC中CCNB1的表達量增高，使細胞G2/M檢測點受損以及導致MPF的增高，該檢測點無法檢測DNA是否損傷，這就會使受到損傷的DNA繼續(xù)進行后續(xù)的有絲分裂，還會導致在分裂期的中期蛋白酶體無法分解和識別全部的MPF，從而導致腫瘤細胞的不斷增殖與發(fā)展[11]，然而在正常細胞周期中，如果有損傷或者非正常的DNA，G2/M期的所合成的MPF活性和相對應的表達含量會受到抑制，使細胞進入有絲分裂期造成一定的阻礙作用，從而抑制了細胞的發(fā)展與增殖，相對應的就是CCNB1 mRNA的表達量相對較小，與本次的研究結果相一致。

本次實驗研究結果表明，CCNB1 mRNA在OSCC中高表達，在性別和年齡的分組中，鱗狀細胞癌組織中男性的CCNB1 mRNA的表達以及大于60 歲的年齡組雖然相比于女性和小于60 歲的年齡組有差異性，但是統(tǒng)計學無意義，說明CCNB1的表達量可能不受到由于年齡或性別原因導致體內激素等水平的改變而增加或減小表達量，然而在病理分級和臨床分期分組來比較，統(tǒng)計學數(shù)據(jù)有意義，隨著OSCC分化程度越低，CCNB1 mRNA的表達量就越高，OSCC的臨床分期越晚，CCNB1 mRNA的表達量也會隨之增高，這兩組比較結果可能說明在OSCC細胞在發(fā)展過程中，CCNB1與鱗狀細胞起到相輔相成的作用，使癌細胞進一步增殖和分化，同樣更多的癌細胞又促使CCNB1的表達量進一步升高，其結果在對乳腺癌[12]、結腸癌[13]、垂體腺瘤[14]、肝癌[15]中CCNB1 mRNA呈高表達具有一致性?？梢酝茰y，在口腔鱗狀細胞癌中，CCNB1的表達含量增高，與CDC2結合后形成MPF，導致腫瘤細胞內MPF過度累積以及基因檢測點的受損，進一步促進了腫瘤細胞生成、增殖與分化，并且與腫瘤的惡性程度及臨床分期有相輔相成的關系。

綜上所述，CCNB1在OSCC中高表達，同時其表達量與分化狀態(tài)和腫瘤細胞的臨床分期及分化狀態(tài)有一定的關系，提示在腫瘤細胞中惡性程度越高，臨床分期越晚，其表達量越高，對于此次研究，未來有望通過調節(jié)CCNB1的表達量或從不同角度對該基因的靶向治療來抑制腫瘤細胞的增殖，為口腔惡性腫瘤的靶向治療提供一個良好的靶點，或者對于CCNB1的促進因素也同樣可以用各種途徑進行抑制，最終的目的都是盡可能的降低CCNB1的表達量促使降低MPF的形成，從分子水平對口腔惡性腫瘤及預后有一個參考標準。