超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛奶中38種抗生素殘留

方 靈，韋 航，黃 彪，劉文靜，蘇德森，吳妙鴻，傅建煒

(福建省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所，福建 福州 350003)

抗生素主要用于預防和治療細菌性感染類疾病，促進畜禽健康生長，以提高養(yǎng)殖質(zhì)量和效率。在奶牛養(yǎng)殖中，抗生素主要用于治療乳牛乳腺炎、腹瀉等疾病[1-2]。泌乳期乳牛若過量使用抗生素或休藥期不足，可能導致牛奶中殘留抗生素，并通過食物鏈對人體健康造成不良影響，如引起胃腸不適、過敏反應、肝功能損害等[3-6]。此外，濫用抗生素或長期攝入含抗生素食品可能會產(chǎn)生細菌耐藥性[7-8]，對人類健康危害更加嚴重，同時，抗生素殘留對環(huán)境中微生物群落也會產(chǎn)生影響，并通過食物鏈影響高級生物，破壞生態(tài)系統(tǒng)[9]。為保障食品安全，我國農(nóng)業(yè)部第235號公告規(guī)定了動物源性食品中抗生素的最大殘留限量(MRL)[10]，許多國家及組織也制定了抗生素最大殘留限量，限量標準日益嚴格。因此，建立一種快速、簡便、靈敏的食品中抗生素檢測方法十分必要。

目前，抗生素的檢測方法主要有微生物法、生物傳感法[11-12]、酶聯(lián)免疫法[13-14]、液相色譜法[15-17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18-21]等。但微生物法、生物傳感法及酶聯(lián)免疫法的特異性不高，靈敏度較差；液相色譜法存在檢測抗生素種類有限、檢出限高等缺點。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)因分析效率高、靈敏度高等優(yōu)勢，成為抗生素殘留分析的主流檢測方法。王浩等[21]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在30 min內(nèi)測定了牛奶中5類35種抗生素殘留，李寧等[19]開發(fā)了牛奶中4類25種抗生素殘留的檢測方法。但已有方法存在操作繁瑣、耗時較長、檢測抗生素種類或數(shù)量相對較少，以及不適于樣品快速篩查分析的不足。抗生素殘留問題日漸突出，由此帶來的潛在風險引起了社會公眾廣泛關注，為確保我國食品和環(huán)境安全，探索一種快速、高效、靈敏的多種類抗生素殘留同時測定方法迫在眉睫。

本文以奶牛養(yǎng)殖業(yè)中常用的抗生素為研究對象，針對不同種類抗生素理化性質(zhì)的差異，優(yōu)化了提取溶劑和凈化條件，考察了基質(zhì)效應，建立了同時測定牛奶中5類(磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類)38種抗生素殘留的UPLC-MS/MS方法。本方法成功應用于實際牛奶樣品中目標抗生素的測定，可為牛奶中多類別、多組分抗生素的快速篩查提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity UPLC H-Class Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；渦旋振蕩器(德國IKA公司)；HGC-36A氮吹儀(天津恒奧有限公司)；KQ-500DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Anke TDL-5-A離心機(上海安亭科學儀器廠)；Milli-Q 超純水器(美國Millipore公司)。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取各標準物質(zhì)適量，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的單標儲備液；量取各單標儲備液0.1 mL至同一10 mL容量瓶中，以甲醇定容并混勻，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標準工作溶液，于-20 ℃下密閉保存。準確移取一定量的混合標準工作溶液，配制成系列空白樣品基質(zhì)匹配標準溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

準確稱取1.00 g牛奶樣品至15 mL 聚丙烯離心管中，加入5 mL 0.5%(體積分數(shù))甲酸乙腈溶液，渦旋振蕩后超聲10 min，以5 000 r/min 離心5 min，取上清液，待凈化。

Oasis PRiME HLB固相萃取小柱經(jīng)5 mL乙腈-水溶液(體積比1∶1)活化平衡后，上樣，流速為1 mL/min，用5 mL乙腈-水溶液(1∶1)洗脫，收集流出液，在40 ℃下氮吹近干，用初始流動相溶解并定容至1 mL，過0.22 μm濾膜后，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 液相色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 μm)；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；流動相：A為0.1%(體積分數(shù))甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～0.20 min，95%A；0.20～2.50 min，95%～50%A；2.50～4.50 min，50%～5%A；4.50～4.51 min，5%～95%A；4.51～8.00 min，95%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；待測磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為正離子模式，毛細管電壓：2.5 kV；氯霉素類抗生素為負離子模式，毛細管電壓：-2.5 kV；多反應監(jiān)測模式(MRM)檢測；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：600 ℃；脫溶劑氣和錐孔氣均為氮氣，流速分別為1 000、150 L/h；碰撞氣為氬氣(純度> 99.999%)，流速為0.15 mL/min。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

5類抗生素在不同離子模式下的響應不同，磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在正離子模式下響應較強，而氯霉素類在負離子模式下響應較強。因此，本研究選擇正、負離子模式同時監(jiān)測以提高效率。

考察了Acquity UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 μm)和Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm i.d.,1.7 μm)對38種抗生素的分離效果。結(jié)果顯示，經(jīng)Acquity UPLC HSS T3色譜柱分離后38種抗生素的峰形相對更佳，這是由于HSS T3柱為硅膠基質(zhì)色譜柱，適用于較寬極性范圍的物質(zhì)分析，對于同時分析多種目標物的效果相對較佳。

通過質(zhì)譜掃描分析，分別對各抗生素進行正離子、負離子掃描，確定各目標物的分子離子，再對分子離子進行二級質(zhì)譜掃描(子離子掃描)，對錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化，選擇響應強度較高的子離子為特征離子。設定駐留時間及采集通道，確保色譜峰采集點數(shù)在12點以上，以得到準確的定量結(jié)果。各抗生素的母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量見表1。

(續(xù)表1)

ClassCompoundRetentiontime(min)Precursorion(m/z)Production(m/z)Conevoltage(V)Collisionenergy(eV)Sparfloxacin(SPA,司帕沙星)3.72393.3292.1/349.3?3724/20Orbifloxacin(ORB,奧比沙星)3.47396.1295.1?/352.14022/14Difloxacin(DIF,雙氟沙星)3.43400.2282.2?/356.13727/21Oxolinicacid(OXO,喹酸)4.14262.0216.0?/244.03030/19Flumequine(FLU,氟甲喹)4.45262.1202.0/244.0?3535/15TetracyclinesDoxycycline(DXC,強力霉素)4.08445.2154.0/428.2?3020/28Tetracycline(TC,四環(huán)素)3.28444.7410.2?/427.33018/14Oxytetracycline(OTC,土霉素)3.33460.7426.2?/444.23418/18Chlortetracycline(CTC,金霉素)3.82479.3444.2?/462.23020/18ChloramphenicolsChloramphenicol(CAP,氯霉素)4.03320.9152.2?/257.2588/16Thiamphenicol(TAP,甲砜霉素)3.14354.1184.9?/226.96018/12Florfenicol(FFC,氟苯尼考)3.60356.2185.1/336.0?5816/8MacrolidesErythrocin(ERY,紅霉素)4.33734.5158.1?/576.53032/20Roxithromycin(ROX,羅紅霉素)4.47937.6158.1?/679.54035/20

*quantitative ion

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化抗生素殘留分析的常用提取溶劑為乙腈、乙腈-水溶液、酸化乙腈等[22-23]。乙腈為中等極性溶劑，與多數(shù)抗生素的極性接近，且能使蛋白質(zhì)變性沉淀。分別考察了乙腈、0.1%甲酸乙腈、0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1.0%甲酸乙腈5種提取溶劑對目標抗生素的提取效率。在空白牛奶樣品中添加38種抗生素混合標準溶液，按照相同方法分析處理，進行加標回收試驗。結(jié)果顯示，采用0.5%甲酸乙腈提取時，38種抗生素的平均回收率相對較高，回收率為76.1%～ 91.0%。因此選擇0.5%甲酸乙腈為提取溶劑。

圖1 不同凈化方法對38種抗生素回收率的影響Fig.1 Effect of different purification method on recoveries of 38 antibiotics

2.2.2 凈化方法的優(yōu)化牛奶中富含的蛋白質(zhì)及脂肪不僅會干擾目標物的分析，也會影響色譜柱壽命，因此需對樣品進行凈化處理。分別比較了Oasis PRiME HLB、C18固相萃取小柱和QuEChERS試劑管對目標抗生素的凈化效果(見圖1)。結(jié)果表明，經(jīng)Oasis PRiME HLB柱凈化后，大部分目標化合物的回收率高于C18柱和QuEChERS試劑管。這可能是由于Oasis PRiME HLB柱中親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮聚合成的固相填料可以很好地吸附脂質(zhì)，凈化效果相對較好，因此選擇Oasis PRiME HLB柱凈化樣品。

2.3 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應(Matrix effect，ME)是基質(zhì)中除目標物以外的其他成分對目標物分析的影響。由于其他成分與目標組分在離子化過程中存在競爭，改變了目標物的電離效率，使目標物的離子響應強度降低或增強，從而影響分析結(jié)果的準確性。通過考察空白樣品基質(zhì)中標準溶液的信號強度(A)與純?nèi)軇┲邢嗤瑵舛葮藴嗜芤盒盘枏姸?B)的比值來評價本方法的基質(zhì)效應，即ME=A/B×100%。結(jié)果顯示，大部分目標抗生素存在不同程度的基質(zhì)效應，其中諾氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、丹諾沙星、沙拉沙星以及4種四環(huán)素類抗生素存在較強的基質(zhì)增強效應，少部分抗生素存在輕微的基質(zhì)抑制效應。為降低基質(zhì)效應影響，提高檢測結(jié)果的準確性，本研究采用空白樣品基質(zhì)匹配標準溶液建立標準曲線，對基質(zhì)效應進行校正。

圖2 空白牛奶樣品中38種抗生素的總離子流圖(定量下限加標水平)Fig.2 Total ion chromatogram of 38 antibiotics in a blank milk sample(spiked with LOQ level)

2.4 線性范圍與定量下限

根據(jù)每種抗生素的響應值，配制系列質(zhì)量濃度的空白樣品基質(zhì)匹配標準溶液，在最佳條件下進行測定，以目標物定量離子的峰面積(Y)為縱坐標，對應質(zhì)量濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，外標法定量。以定量離子10倍信噪比(S/N=10)得到定量下限(LOQ)，方法的線性范圍、LOQ結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，38種目標抗生素在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關系，相關系數(shù)(r2)均大于0.99，LOQ為0.10～1.0 μg/kg。

2.5 回收率及相對標準偏差

在空白牛奶基質(zhì)中分別添加1.0、5.0、10.0 μg/kg 3個水平的混合標準溶液，按照相同方法處理后進行UPLC-MS/MS測定，每個水平重復測定6次，計算回收率及相對標準偏差(RSD)。由表2可知，在3個加標水平下，38種目標抗生素的平均回收率為70.7%～ 94.9%，RSD為4.0%～ 9.4%。在LOQ加標水平下，空白牛奶基質(zhì)中添加目標化合物后的總離子流色譜圖見圖2。結(jié)果表明，該方法能滿足牛奶中38種抗生素殘留的日常檢測要求。

表2 38種抗生素的線性范圍、定量下限、加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Linear ranges,LOQs,recoveries and relative standard deviations of 38 antibiotics(n=6)

2.6 實際樣品分析

表3 牛奶樣品中抗生素的含量(n=3)Table 3 Contents of antibiotics in milk samples(n=3) w/(μg·kg-1)

*average value±standard deviation；**not detected

3 結(jié) 論

本研究建立了UPLC-MS/MS同時測定牛奶中5類(磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類)38種抗生素殘留的分析方法，對提取溶劑、凈化方式等因素進行了優(yōu)化。在最佳條件下，38種抗生素在各自線性范圍內(nèi)具有良好的線性關系，LOQ為0.10～1.0 μg/kg，在低、中、高3個加標水平下的平均回收率為70.7%～ 94.9%，RSD為4.0%～9.4%，各指標均滿足分析檢測的要求。該方法對于牛奶中多類別、多組分抗生素殘留的分析監(jiān)測、快速篩查具有參考意義。