鑒別診斷雞傳染性法氏囊病RT-PCR方法的建立

嚴(yán)紅亞，趙鶴庭,2，趙蓉，信愛國，常志順*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 養(yǎng)禽與禽病研究所，云南 昆明 650224；2.洱源縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 洱源 671200)

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起，主要侵害雞淋巴組織，特別是法氏囊組織[1]。IBDV的核酸為線性雙股RNA，目前普遍認(rèn)為影響該病毒抗原及毒力的變異主要發(fā)生在VP2基因，其編碼的結(jié)構(gòu)蛋白是主要宿主保護(hù)性抗原，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)和識(shí)別等有關(guān)。根據(jù)毒力差異，IBDV可分成超強(qiáng)毒株(very virulent IBDV, vvIBDV)、經(jīng)典毒株(classical IBDV，cIBDV)、變異毒株(variant IBDV, vIBDV)和致弱毒株(疫苗株)。IBD主要造成雞的免疫抑制，引起雞死亡或者導(dǎo)致感染雞的免疫應(yīng)答能力降低、抵抗力下降和生長(zhǎng)抑制等，使其易受到其他病原的并發(fā)及繼發(fā)感染，給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的損失。

快速檢測(cè)IBDV對(duì)該病的防控具有重要的意義。目前，國內(nèi) IBDV快速檢測(cè)方法主要有 RT-PCR[3]、熒光定量 RT-PCR 法[4]、雙抗體夾心 ELISA[5]和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)[6]等分子生物學(xué)方法。本文建立了特異性檢測(cè)IBDV和區(qū)分IBDV超強(qiáng)毒株(vvIBDV)和經(jīng)典毒株(cIBDV)的RT-PCR方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)購自湖南中岸生物藥業(yè)有限公司，雞白痢沙門氏菌、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒均為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存，禽流感病毒H9血凝抗原購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 主要試劑

病毒RNA提取試劑(RNAiso Plus)購自寶生物工程(大連)有限公司，病毒cDNA合成試劑盒(TransScript one-step gDNA cDNA synthesis Super Mix)購自天根生化科技(北京)有限公司。PCR試劑(2×High-Fidelity Master Mix)購自上海捷瑞生物工程有限公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 引物合成

IBD病毒VP2基因片段為高變異區(qū)，采用文獻(xiàn)報(bào)道的引物[2]，針對(duì)VP2基因建立IBDV通用檢測(cè)和區(qū)分毒株毒力強(qiáng)弱的RT-PCR方法(表1)。其中引物對(duì)IBDVF/IBDVR用于IBDV檢測(cè)基礎(chǔ)PCR擴(kuò)增，引物對(duì)IBDVf/IBDVr用于IBDV檢測(cè)巢式PCR擴(kuò)增；引物對(duì)vvIBDVF/vvIBDVR和引物對(duì)cIBDVF/cIBDVR分別用于區(qū)分IBDV超強(qiáng)毒株和經(jīng)典毒株。引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成。

1.4 病毒RNA提取和cDNA的合成

取200μL傳染性法氏囊病活疫苗原液，用RNAiso Plus試劑提取病毒總RNA，最終溶解于40mL RNase-Free ddH2O中，-70℃保存?zhèn)溆?。取上述所提RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的體系為：5×gDNA Buffer 2μL、Total RNA 8mL,42℃孵育3min，置于冰上放置。10×King RT Buffer 2μL 、FastKing RT Enzyme Mix 1μL 、IBDV通用反轉(zhuǎn)錄引物為隨機(jī)引物，總體系為20μL；反應(yīng)條件為42℃ 15min、95℃ 3min，合成的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增。

表1 引物信息

1.5 傳染性法氏囊病PCR檢測(cè)

以上述獲得的cDNA產(chǎn)物為模板，針對(duì)傳染性法氏囊病VP2基因高變區(qū)，建立IBDV檢測(cè)方法。PCR反應(yīng)為25μL體系：2×High-Fidelity Master Mix 12.5 μL、ddH2O 10.5μL、IBDV VP2基因基礎(chǔ)引物(IBDVF/ IBDVR)或經(jīng)典毒株引物(cIBDVF/cIBDVR)、超強(qiáng)毒株引物(vvIBDVF/ vvIBDVR)各0.5μL、cDNA模板1μL，混勻。擴(kuò)增條件：94℃ 3min、94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。巢式PCR以第一次基礎(chǔ)PCR產(chǎn)物為模板再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，巢式PCR引物為IBDVf/ IBDVr，擴(kuò)增條件：94℃ 3min、94℃ 1min、60℃ 45s、72℃ 30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后取5μL產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳觀察和成像系統(tǒng)拍照分析。

1.6 特異性測(cè)定

分別提取雞白痢沙門氏菌、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒基因組，按上述方法進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證建立方法的特異性。

1.7 樣品檢測(cè)

取2份送檢的疑似傳染性法氏囊病樣品及臨床健康雞肛拭子樣品1份，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA后，采用上述方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，鑒定IBDV，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2.0% 瓊脂凝膠電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 IBDV基礎(chǔ)PCR 檢測(cè)結(jié)果

提取病毒RNA，利用試劑盒通用檢測(cè)引物獲得病毒cDNA，針對(duì)IBDV VP2基因設(shè)計(jì)基礎(chǔ)PCR引物和巢式PCR 引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)IBDV。結(jié)果獲得679bp 目的條帶(見圖1)。表明該方法能夠檢測(cè)出IBDV，可以用于IBDV的臨床檢測(cè)。

1：IBDV B87毒株陽性； 2：陰性對(duì)照

2.2 IBDV巢式PCR 檢測(cè)結(jié)果

利用基礎(chǔ)PCR 所獲得的產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行巢式PCR 檢測(cè)。獲得預(yù)期471bp目的條帶(見圖2)。表明當(dāng)樣品中病毒含量較少時(shí)，巢式PCR 可用于IBDV的檢測(cè)。

1：IBDV B87毒株陽性； 2：陰性對(duì)照

2.3 IBDV經(jīng)典毒株和超強(qiáng)毒株的鑒別

提取病毒RNA，利用試劑盒通用檢測(cè)引物獲得病毒cDNA，針對(duì)IBDV超強(qiáng)毒株和經(jīng)典毒株設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果獲得相應(yīng)的目的條帶(見圖3)。表明可用該方法區(qū)分IBDV超強(qiáng)毒株和經(jīng)典毒株。

1：經(jīng)典毒株； 2：超強(qiáng)毒株

2.4 IBDV特異性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)雞白痢沙門氏菌、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒H9血凝抗原進(jìn)行IBDV檢測(cè)，結(jié)果顯示上述病原檢測(cè)物特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，說明該方法對(duì)檢測(cè)IBDV具有特異性。

2.5 IBDV樣品基礎(chǔ)PCR檢測(cè)鑒定結(jié)果

用建立的方法檢測(cè)驗(yàn)證IBDV樣品，通過基礎(chǔ) RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，疑似IBDV樣品基礎(chǔ)PCR可擴(kuò)增出679bp預(yù)期條帶，來源于健康雞肛拭子樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性，見圖4。

1、2：疑似IBDV臨床樣品； 3：健康雞肛拭子；4：陰性對(duì)照

用建立的巢式PCR方法檢測(cè)驗(yàn)證IBDV樣品，結(jié)果顯示，IBDV疑似樣品均可擴(kuò)增出471bp預(yù)期條帶，來源于健康雞肛拭子樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性，見圖5。說明IBDV疑似樣品為傳染性法氏囊病陽性，健康雞肛拭子樣品為傳染性法氏囊病陰性。

1、2：疑似IBDV臨床樣品； 3：健康雞肛拭子；4：陰性對(duì)照

鑒定傳染性法氏囊病毒樣品經(jīng)典毒株和超強(qiáng)毒株，結(jié)果獲得大小為137bp的經(jīng)典毒株目的條帶(見圖6)，超強(qiáng)毒株條帶為陰性(結(jié)果未顯示)。說明IBDV陽性樣品為傳染性法氏囊病經(jīng)典毒株。

1、2：IBDV陽性樣品； 3：陰性對(duì)照

3 討論

雞傳染性法氏囊病可直接引起雞只死亡，還可損傷病雞免疫系統(tǒng)，造成病雞抵抗力下降，易受到其他多種病原微生物的感染?？焖僭\斷和鑒別IBDV是預(yù)防控制該病的重要手段。RT-PCR方法是從基因水平檢測(cè)IBDV，具有敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。與常規(guī)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、病毒血清中和試驗(yàn)等方法相比，檢測(cè)更快速、更準(zhǔn)確[7-9]。用RT-PCR方法鑒定IBDV不需要增值病毒，在病毒含量較低時(shí)采用巢式PCR可以準(zhǔn)確鑒定檢測(cè)結(jié)果，提高檢測(cè)效率。1999年陳紅英等[10]采用套式RT-PCR檢測(cè)IBDV，由于引物特異性不高等問題限制了在臨床上的運(yùn)用和推廣。本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速準(zhǔn)確鑒定IBDV的方法，針對(duì)IBDV的VP2基因設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，針對(duì)經(jīng)典毒株和超強(qiáng)毒株分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于鑒定IBDV和區(qū)分經(jīng)典毒株和超強(qiáng)毒株，并進(jìn)行相關(guān)特異性、重復(fù)性等實(shí)驗(yàn)。該方法具有較好的特異性和重復(fù)性，與禽類相關(guān)病毒、細(xì)菌不發(fā)生交叉反應(yīng)，能夠運(yùn)用于臨床上IBDV的快速檢測(cè)，為傳染性法氏囊病疫情的監(jiān)測(cè)和控制提供了有效手段。