異檸檬酸脫氫酶1基因R132H突變與膠質瘤相關性癲癇患者術后癇性再發(fā)的關系

曾凡濤 王新軍 楊卓 王修成 袁小威

鄭州大學第五附屬醫(yī)院神經外科（鄭州450052）

膠質瘤是常見的神經系統(tǒng)腫瘤，常導致癲癇 的發(fā)生［1］。膠質瘤相關性癲癇患者不僅需要手術切除膠質瘤，還需手術切除瘤周致癇灶以控制癲癇發(fā)作［2］。盡管手術治療在病灶及腫瘤致癇灶完全切除的情況下對癲癇有較好的控制，然而術后癲癇可能繼續(xù)存在，癲癇再發(fā)嚴重影響了患者的恢復和生存質量［3］。與非膠質瘤相關性癲癇相比較，膠質瘤相關性癲癇對抗癲癇藥物的反應性較差，預后不良［4］。已有研究表明，異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）基因突變類型中最常見的為R132H 型突變（編碼蛋白的氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻M氨酸），此種類型突變占所有IDH1 突變類型的90%左右［5］。突變主要存在于Ⅱ、Ⅲ級及繼發(fā)性膠質母細胞瘤（Ⅳ級）中，且對患者的預后有重要影響［6］。研究［7-10］表明，在Ⅱ～Ⅳ級膠質瘤相關性癲癇患者中，突變與患者術前癲癇發(fā)作有密切關聯(lián)。但該突變與患者術后癇性再發(fā)的關系卻較少報道。為此，本研究通過免疫組化法檢測膠質瘤相關性癲癇患者腫瘤組織中IDH1 R132H 突變情況，并探討該突變與患者術后癇性再發(fā)的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年3月至2017年3月于鄭州大學第五附屬醫(yī)院手術治療的90 例膠質瘤相關性癲癇患者。男49 例，女41 例，年齡21～68歲，平均（50.2 ± 17.5）歲。WHO 分級：Ⅱ級27 例，Ⅲ級18 例，Ⅳ級45 例。顳葉腫瘤35 例，非顳葉腫瘤55 例。入選標準：（1）術前CT/MRI 檢查提示顱內占位、術后病理學檢查明確診斷為膠質瘤；（2）根據(jù)臨床癥狀、腦電圖（EEG）、2010年國際抗癲癇聯(lián)盟（ILAE）標準確診為癲癇，術中皮層腦電圖定位顯示癲癇灶與腫瘤部位大致相同；（3）首次接受手術治療；（4）未接受任何放化療，但術后均服用1種或1 種以上一線抗癲癇藥物治療。排除標準：（1）精神心理異常者；（2）因顱內感染、顱腦創(chuàng)傷、腦血管疾病及大腦發(fā)育異常等可能誘發(fā)癲癇發(fā)作的病史；（3）術后隨訪期內因各種并發(fā)癥死亡的患者。

1.2 資料收集 對患者隨訪至術后1年，中途無失訪患者。根據(jù)患者術前病情、術后恢復情況，重新調整患者抗癇藥的使用并記錄其服藥數(shù)量。腫瘤累及部位、腫瘤切除范圍及術后腫瘤是否復發(fā)由CT/MRI 檢查獲得。對手術切除的標本行常規(guī)石蠟包埋等處理。入選標本及相關臨床信息均已獲患者家屬及醫(yī)院倫理委員會同意。

1.3 主要試劑與儀器 mIDH1 R132H 單克隆抗體型號1L-226（日本株式會社免疫生物研究所）；二抗反應增強液型號PV-9000、二抗增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG 聚合物及DAB 顯色液型號ZLI-9019（北京中杉金橋生物技術有限公司）；熒光顯微鏡購自日本Nikon 公司。

1.4 IDH1 R132H 突變檢測及評判 將包埋標本以3 μm 厚連續(xù)切片，置于防脫劑預處理后的載玻片上。滴加mIDH1 R132H 抗體（稀釋比為1∶100）于4 ℃冰箱孵育過夜；PBS 緩沖液清洗，后添加反應增強液、增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG 復合物，DAB 顯色液鏡下顯色觀察；蘇木素復染、清水返藍后中性樹膠封片，鏡下觀察。以PBS 緩沖液代替一抗作對照。腫瘤細胞胞質內有棕黃色或黃褐色顆粒為陽性。由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法閱片和雙評分半定量法進行評分，光鏡下隨機觀察8個高倍鏡視野，記錄4 個高倍視野（× 400）中染色陽性百分率，以陽性細胞超過10%為IDH1 R132H突變陽性。

1.5 統(tǒng)計學方法 運用生物統(tǒng)計學軟件IBM SPSS 25.0 對數(shù)據(jù)進行處理與分析。對數(shù)據(jù)行KS 正態(tài)性檢驗，定量資料用表示，兩組間定量資料行t檢驗；計數(shù)資料行卡方或Fisher 確切概率法檢驗；采用Cox 回歸模型對術后癇性再發(fā)行多因素分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膠質瘤相關性癲癇患者腫瘤組織IDH1 R132H 突變情況 對90 例患者的腫瘤組織行mIDH1 R132H 突變檢測，可見不同程度棕黃色或黃褐色的陽性信號表達（圖1），其中突變型32 例，野生型58 例，總體突變率為35.6%。突變型患者平均年齡為（37.1 ± 11.6）歲，野生型為（57.2 ±11.6）歲，兩者間比較差異有統(tǒng)計學意義（t=11.547，P＜0.001）。突變主要發(fā)生在Ⅱ、Ⅲ級膠質瘤中；腫瘤組織病理分型中突變以彌漫性星形細胞瘤和間變性星形細胞瘤居多；此外，該突變在膠質瘤術后復發(fā)患者及術后服用較多數(shù)量抗癲癇藥患者中所占比例大，且差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 膠質瘤相關性癲癇患者術后癲癇再發(fā)的相關因素分析 對所有患者隨訪至術后1年，對其行Engle 分級評分，以此作為術后癲癇有無再發(fā)的分組依據(jù)，將EngleⅠ級視為術后癲癇未發(fā)作，其余視為癲癇再發(fā)。其中，癇性再發(fā)38 例，癇性未發(fā)52 例，再發(fā)率42.2%（38/90）。未發(fā)組中突變率為15.4%，再發(fā)組中突變率為63.2%，兩者間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=21.869，P＜0.001）。對術后癲癇再發(fā)行單因素分析，結果顯示腫瘤組織WHO 分級、腫瘤位于顳葉、腫瘤及致癇灶鏡下全切、腫瘤術后復發(fā)、患者術后服用抗癇藥數(shù)量以及IDH1 R132H突變與術后癇性再發(fā)有關（P＜0.05），見表2。將上述因素納入Cox 回歸模型中行多因素分析顯示：腫瘤位于顳葉、腫瘤術后復發(fā)以及IDH1 R132H 突變是患者術后癇性再發(fā)的獨立危險因素，而腫瘤及致癇灶鏡下全切則為其獨立保護因素，見表3。

圖1 膠質瘤組織中IDH1 R132H 型突變的表達（×400）Fig.1 Expression of IDH1 R132H type mutation in glioma tissues（×400）

表1 患者基本臨床特征及IDH1 R132H 突變情況Tab.1 Basic clinical characteristics of patients and IDH1 R132H mutation 例（%）

表2 影響患者術后1年內癇性再發(fā)的單因素分析Tab.2 Univariate analysis of patients with epileptic recurrence within 1 year after surgery 例（%）

表3 影響患者術后1年內癇性再發(fā)的Cox 多因素回歸分析Tab.3 Cox multivariate regression analysis of patients with epileptic recurrence within 1 year after surgery

3 討論

本研究顯示膠質瘤相關性癲癇患者腫瘤組織中IDH1 R132H 突變率為35.6%，且突變型患者平均年齡較野生型?。煌蛔冎饕l(fā)生在Ⅱ、Ⅲ級膠質瘤中，分別為63.0%（17/27）和66.7%（12/18）；不同組織病理分型中突變也存有一定的差異性，以彌漫性星形細胞瘤和間變性星形細胞瘤居多。以上研究結果與先前國內外研究報道基本相一致［8，11］。術后腫瘤復發(fā)患者突變概率較大，達57.1%（24/42）?？赡艿脑蚴荌DH1 R132H 突變型膠質瘤血管內皮生長因子（VEGF）含量較高，而該突變破壞其本身親和力，與底物結合能力減弱的同時也與IDH1 野生型競爭底物，阻斷IDH1 活性，最終促使腫瘤復發(fā)和增殖［12］。此外，突變在患者術后服用抗癲癇藥數(shù)量間也存有明顯差異，服用抗癇藥數(shù)量≥3 種的患者腫瘤組織IDH1 R132H突變較高，這與國外研究［13］結論相一致。據(jù)此筆者推測突變促使腫瘤復發(fā)和增殖，而膠質瘤的增殖可能形成癲癇病灶復合體［14］，引發(fā)腦組織異常放電，導致術后癲癇頻繁發(fā)作，從而需服用較多數(shù)量（≥3 種）的抗癇藥物對癲癇進行控制。

已有研究表明［15］，大約有86%的患者癲癇再發(fā)于術后1年內，且易形成難治性癲癇，因此本研究選擇對患者隨訪至術后1年。有研究［16-17］顯示腫瘤位于顳葉及腫瘤術后復發(fā)是影響患者術后癇性再發(fā)的獨立危險因素，本組研究結論與其相一致。腫瘤及致癇灶鏡下全切則為其獨立保護因素，這也與已有的研究［2］結論相符合。本研究顯示IDH1 R132H 突變?yōu)榛颊咝g后癇性再發(fā)的獨立危險因素。在目前少量已報道的文獻中，國內有學者對低級別膠質瘤患者中IDH1 突變與術后6 個月內癇性再發(fā)的關系進行了研究，結果顯示IDH1突變對患者術后癇性再發(fā)無影響［18］，這與本研究結論相反。筆者推測膠質瘤中IDH1 R132H 突變有可能是在患者手術半年后對癲癇再發(fā)產生了重要影響，也有可能僅僅是IDH1 R132H 型突變對患者術后癇性再發(fā)產生了影響，而其他類型突變則對其無影響，這都需要本研究組后期做進一步的研究加以驗證。國外也有學者對膠質瘤IDH1 R132H 突變與術后癲癇再發(fā)頻率間的關系進行了研究，結果顯示術后1年內該突變在癇性未發(fā)作患者及癇性發(fā)作頻率較高患者（平均＞1 次/月）間差異有統(tǒng)計學意義，術后癇性發(fā)作頻率較高的腫瘤患者（平均＞1 次/月）IDH1 R132H 突變率較高，且該突變是其獨立危險因素［13］，本研究所得結論與其有相似之處。到目前為止，有關膠質瘤中IDH1 R132H 突變的潛在致癇機制現(xiàn)已有一定的研究，可能的原因是IDH1 突變細胞產生2-羥基戊二酸（D2-HG）［19］，D2-HG 在結構上與谷氨酸相似且能激活N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體［20］，從而導致了術后癲癇再發(fā)。此外，外源性D2-HG 將培養(yǎng)的大鼠神經元放電率提高了4～6 倍，而D2-HG 的這種興奮作用能選擇性被NMDA 受體拮抗劑完全阻斷［8］，同時也揭示D2-HG 可能對瘤周組織具有重要致癇作用，這將為膠質瘤相關性癲癇患者手術切除瘤周組織進一步提供理論依據(jù)。

本組研究中經Cox 多因素回歸分析顯示，患者術后服用抗癇藥的數(shù)量、不同腫瘤組織WHO 分級對患者術后1年內癇性再發(fā)的差異無統(tǒng)計學意義，為其混雜因素，這與已有研究結論［13，21］分別相一致。表1中顯示膠質瘤IDH1 R132H 突變與以上兩者有一定關聯(lián)，據(jù)此筆者推測患者術后服用抗癇藥的數(shù)量和不同腫瘤組織WHO 分級有可能是通過IDH1 R132H 突變間接對患者術后癇性再發(fā)產生了一定影響，但這需要后續(xù)更多的研究來證實。

綜上所述，本研究分析了膠質瘤相關性癲癇患者腫瘤組織IDH1 R132H 突變及其對患者術后1年內癇性再發(fā)的影響，對該突變的潛在致癇作用有了進一步的了解。隨訪時間偏短及樣本量有限是本研究的不足之處，后續(xù)將繼續(xù)收集病例，延長隨訪時間，通過基因測序法進一步論證IDH1 突變對患者術后不同時間段內癲癇再發(fā)的影響。