肺癌組織中GARP陽性Treg細(xì)胞浸潤水平及臨床特征的關(guān)系

廖明 王昂 禤藝文 彭麗君 唐勇

1 中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院胸外科（廣州510010）；2廣東省第二人民醫(yī)院腫瘤一科（廣州510317）

近年來，眾多證據(jù)［1-2］表明腫瘤微環(huán)境在腫瘤病情進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。腫瘤具有先天性和獲得性免疫的浸潤細(xì)胞，例如髓源性抑制細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹突細(xì)胞，肥大細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，NK 細(xì)胞和淋巴細(xì)胞［3］，構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)了腫瘤逃避免疫監(jiān)視和生長［4］。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）作為主要的免疫抑制細(xì)胞，可以抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［5］。Tregs 的免疫抑制活性使其成為免疫治療的有效靶點(diǎn)之一，但目前對于Tregs 在組織中的檢測受到缺乏特異性標(biāo)志物的限制。Foxp3 是Tregs 的發(fā)育和功能所必需的轉(zhuǎn)錄因子［6］，但由于Foxp3 位于細(xì)胞核中，并且它也可以在常規(guī)T 細(xì)胞中表達(dá)［7］，因此多種細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子的Foxp3 影響了對組織中Tregs 浸潤程度的判斷。糖蛋白A 為主重復(fù)序列（glycoprotein A repetitions predominant，GARP），一種由662 個(gè)氨基酸殘基組成的跨膜蛋白，在某些Tregs 亞群的表面高度表達(dá)，并通過T 細(xì)胞受體刺激激活［8］。GARP 陽性Tregs 成為TGF-β分泌的重要來源，因此，GARP 陽性Tregs 亞群具有很強(qiáng)的免疫抑制作用［9］。然而，GARP + Tregs 在腫瘤微環(huán)境中的浸潤水平以及其作用值得進(jìn)一步探討。本研究擬通過檢測肺癌腫瘤組織中GARP 陽性Treg 細(xì)胞浸潤水平，并分析GARP 陽性Treg 浸潤水平和肺癌患者臨床特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年2月至2018年1月因肺癌于我院行手術(shù)治療患者共93 例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后病理確診為肺癌；（2）臨床資料完整；（3）術(shù)前未進(jìn)行放療、化療和靶向治療；（4）獲得患者知情同意；排除合并免疫性疾病以及全身多發(fā)腫瘤患者；本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。93 例肺癌患者中男51 例，女42 例，平均年齡（56.4±7.6）歲，范圍38～76 歲，其中TNM 分期為Ⅰ期29 例，Ⅱ期27 例，Ⅲ期26 例，Ⅳ期11 例。

1.2 臨床標(biāo)本收集和免疫組化 免疫組化染色由我院病理科醫(yī)師進(jìn)行，取手術(shù)切除的肺癌組織樣品，常規(guī)固定在10%中性緩沖福爾馬林中并包埋在石蠟中。將石蠟包埋的肺癌組織和癌旁組織切成4 μm 厚的切片，并將切片脫蠟脫水后，采用3%過氧化氫處理組織切片，再用PBS 沖洗3 遍。按照以下步驟進(jìn)行抗原修復(fù)：將切片浸入EDTA 溶液（pH8.0）中，并用微波加熱樣品。采用胎牛血清處理30 min 以減少非特異性結(jié)合，一抗Anti-GRAP antibody 夠自（Abcam，ab97344），在4 ℃孵育過夜。在第一抗體反應(yīng)后，將樣品與HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（Abcam，ab6721）室溫孵育30 min。通過使用二氨基聯(lián)苯胺底物顯色，然后用蘇木精復(fù)染載玻片后封片。由兩名病理科醫(yī)師隨機(jī)選擇肺癌癌組織和癌旁組織切片的5 個(gè)視野（×200）進(jìn)行拍照后進(jìn)行分析。

1.3 免疫組化評估 通過Image-Proplus 6.0 軟件測量組織照片中肺癌組織和癌旁組織的GRAP 陽性Treg 細(xì)胞在組織中的浸潤密度。所有圖像均使用相同的顯微鏡和相機(jī)組拍攝。具體操作為先通過軟件使所有測量照片的背景一致后，采用軟件分析GRAP 陽性Treg 細(xì)胞的特征顏色，再根據(jù)該顏色計(jì)算整個(gè)照片中的細(xì)胞數(shù)，采用“細(xì)胞數(shù)/視野”表示組織中GRAP 陽性Treg 細(xì)胞的浸潤密度，其中93 例肺癌患者肺癌GARP 陽性Treg 的中位陽性細(xì)胞數(shù)為28 個(gè)/視野，因此以肺癌組織中浸潤GARP 陽性Treg＞28 個(gè)/視野的為高浸潤組（46 例），≤28 個(gè)/視野的患者為低浸潤組（47 例）。具體GARP 陽性Treg 在肺癌組織和正常肺組織中的浸潤情況見圖1。

圖1 GARP 陽性Treg 在肺癌組織中的浸潤情況（×200）Fig.1 Infiltration of GARP-positive Tregs in lung cancer tissues

1.4 臨床資料收集 記錄所有納入研究患者的年齡、性別、吸煙史、病理組織分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、臨床TNM 分期。比較GRAP 陽性Treg 細(xì)胞浸潤高浸潤和低浸潤的患者其臨床特征的關(guān)系，對比兩組患者的隨訪預(yù)后結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。使用Kaplan-Meier 生存曲線對比肺癌患者GARP 陽性Treg 浸潤高浸潤和低浸潤組患者的生存情況，并使用Logrank 檢驗(yàn)對比兩組生存差異，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁組織的GARP 陽性Treg 浸潤密度對比 其中93 例肺癌患者中，癌組織的平均GARP 陽性Treg 浸潤密度為（25.3 ± 8.6）個(gè)/視野，癌旁正常肺組織的GARP 陽性Treg 浸潤密度為（7.2±4.6）個(gè)/視野，其中肺癌組織中的GARP 陽性Treg 浸潤密度顯著高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.2 GARP 陽性Treg 在肺癌中的浸潤水平與臨床特征的關(guān)系 其中肺癌組織中GARP 陽性Treg高浸潤水平與患者TNM 分期、淋巴結(jié)侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其中TNM 分期為Ⅲ-Ⅳ期、淋巴結(jié)存在侵襲、出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌組織其高浸潤GARP 陽性Treg 的患者比例顯著增高（P＜0.05），而GARP 陽性Treg 的浸潤密度在患者的性別、年齡、是否吸煙、組織類型上差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 GARP 陽性Treg 在肺癌中的浸潤水平與臨床特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between GARP-positive Treg infiltration and clinical features in lung cancer例

2.3 肺癌組織中GARP 陽性Treg 浸潤密度對肺癌臨床預(yù)后的影響 93 例肺癌患者隨訪時(shí)間為8～46 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為32 個(gè)月，GARP 陽性Treg 高浸潤的患者其總體生存率為65.2%（30/46），而GARP 陽性Treg 低浸潤的患者其總體生存率為87.2%（41/47），其中GARP 陽性Treg 高浸潤的肺癌患者其總體生存率顯著低于低浸潤的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=2.521，95CI%：1.087 ～5.850，P=0.031）。見圖2。

圖2 GARP 陽性Treg 在肺癌組織的浸潤程度對肺癌患者總體生存率的影響Fig.2 Effect of GARP-positive Treg on the degree of invasion of lung cancer tissue on overall survival of lung cancer patients

2.4 肺癌患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析 將納入的因素采用Logistic 回歸模型進(jìn)行分析，變量與賦值如下：TNM 分期（Ⅰ～Ⅱ=0，Ⅲ～Ⅳ=1）；淋巴結(jié)侵襲（否=0，是=1）；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（否=0，是=1）；GARP 陽性Treg（低浸潤=0，高浸潤=1）；結(jié)局（存活=0，死亡=1）。發(fā)現(xiàn)肺癌患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（OR=6.55，P=0.011）與GARP 陽性Treg 高浸潤（OR=4.29，P=0.036）是患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)因素。

3 討論

Tregs 作為主要免疫抑制細(xì)胞，在腫瘤的病情進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。研究［10］表明，如細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4）、腫瘤壞死因子受體2（tumor necrosis factor receptor 2，TNFR-2）、淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte activation gene 3）、T 細(xì)胞膜蛋白3（T cell membrane protein 3）和GARP分子均有助于增強(qiáng)Tregs 的免疫抑制，但對于Tregs具體調(diào)節(jié)其免疫抑制功能的確切機(jī)制尚不清楚，這些分子在調(diào)節(jié)Tregs 作用中的確切作用也未明確。GARP 也稱為富含亮氨酸重復(fù)序列32，研究［11］表明GARP 可以在活化的CD4+Foxp3+Tregs 和巨核細(xì)胞/血小板的表面上結(jié)合TGF-β/LAP。GARP且能誘導(dǎo)Foxp3 表達(dá)，使Tregs 抑制效應(yīng)細(xì)胞活化［12］。既往研究［13］表明，GARP 表達(dá)陽性的Tregs具有很高的免疫抑制作用，而GARP 可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路是該表型的集中Tregs 發(fā)揮抑制功能的主要方式。目前對于GARP 主要在乳腺癌、結(jié)腸癌和黑色素瘤中進(jìn)行了初步的研究［14］，但對于GARP 陽性的Treg 浸潤與肺癌的臨床特征的關(guān)系仍未完全明確，因此，本研究擬探討GARP 陽性的Treg細(xì)胞的浸潤水平與臨床特征的關(guān)系。

本研究首先比較了肺癌組織和癌旁組織中GARP 陽性Tregs 的浸潤程度，結(jié)果顯示了癌組織中的GARP 陽性Tregs 浸潤密度顯著高于正常的肺組織。既往研究報(bào)道肺癌患者中血液的Tregs 細(xì)胞比例比健康的人群顯著增高［15］，進(jìn)一步揭示了來自腫瘤組織中能募集GARP 陽性的Tregs 從而發(fā)揮免疫抑制的效果。本研究進(jìn)一步分析GARP 陽性Tregs 浸潤密度與肺癌患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GARP 陽性Treg 高浸潤水平與患者TNM分期、淋巴結(jié)侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這表明GARP 陽性Treg 在腫瘤中浸潤時(shí)能發(fā)揮促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。目前對于癌組織中的GARP表達(dá)和功能仍未完全明確，在免疫抑制的腫瘤微環(huán)境中可能是促進(jìn)腫瘤免疫逃逸和治療失敗的重要因素，其中抑制性免疫細(xì)胞如Tregs 和抑制性因子如TGF-β 等在癌癥發(fā)展和進(jìn)展中起重要作用。體外研究［16］表明，從通過誘導(dǎo)Tregs 的GARP表達(dá)可以促進(jìn)黑素瘤組織中M2 型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化并抑制效應(yīng)T 細(xì)胞的功能。用T 細(xì)胞抗原受體刺激T 輔助細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)GARP，可誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入功能抑制性Foxp3 + Tregs，敲除Foxp3+ Tregs 上的GARP 表達(dá)會(huì)降低Treg 的免疫抑制活性［17］。因此，GARP 可能是調(diào)控Treg 細(xì)胞的重要因子，其表達(dá)水平與Treg 的抑制功能密切相關(guān)。

本研究的病理結(jié)果也顯示肺癌組織中GARP能作為Tregs 表面特異性表達(dá)的分子標(biāo)記物，筆者進(jìn)一步對比分析了GARP 陽性Treg 高浸潤和低浸潤肺癌患者的預(yù)后情況，結(jié)果顯示肺癌組織GARP陽性Treg 高浸潤的患者顯著預(yù)后不良。排除其它因素的影響后，多因素Logistic 回歸分析的結(jié)果也顯示了肺癌組織GARP 陽性Tregs 高浸潤是肺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，表明GARP 陽性Tregs 有機(jī)會(huì)成為反映肺癌患者預(yù)后的重要生物分子標(biāo)記物。因此，在Tregs 上發(fā)現(xiàn)GARP 作為標(biāo)記物能為闡明Tregs 的功能和機(jī)制具有重要作用，但具體其在肺癌中的調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。

由于本研究納入的患者比較少，仍需要進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行評估。綜上，肺癌患者中的肺癌組織GARP 陽性Treg 浸潤顯著增高，GARP 陽性Treg 高浸潤水平與患者TNM 高分期、淋巴結(jié)侵襲、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。