miR-17-5p靶向PTEN促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥

羅凱 黎謝夢(mèng)丹 鄭國(guó)沛 劉浩 賈小婷 王倩 張志杰 賀智敏

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/廣州醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所（廣州510095）

肺癌是嚴(yán)重威脅大眾健康的重要惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占80% ～85%。目前，以吉非替尼為代表的表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）已成為EGFR 突變型NSCLC 的重要全身治療手段之一，然而無(wú)可避免的EGFR-TKI 耐藥嚴(yán)重影響了其臨床應(yīng)用［1］。目前仍有相當(dāng)比例患者耐藥機(jī)制未明［2］。因此，進(jìn)一步尋找EGFRTKI 耐藥靶標(biāo)，闡述耐藥機(jī)制對(duì)于有效逆轉(zhuǎn)EGFRTKI 耐藥，提高肺癌綜合治療效果具有十分重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

miRNA 是一類(lèi)20 bp 左右的單鏈小分子RNA，其主要通過(guò)與靶基因mRNA 的3′非翻譯區(qū)的部分或完全結(jié)合來(lái)抑制靶基因mRNA 的翻譯過(guò)程或促進(jìn)其降解。越來(lái)越多的研究表明miRNA 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中發(fā)揮了重要的作用［3-4］。該研究前期已利用吉非替尼敏感NSCLC 細(xì)胞HCC827成功構(gòu)建了繼發(fā)耐藥細(xì)胞株HCC827/G 且還排除了目前已知的主要耐藥機(jī)制在HCC827/G 吉非替尼耐藥中的作用，如EGFR 基因T790M 突變等，同時(shí)二代測(cè)序結(jié)果顯示HCC827 和HCC827/G 細(xì)胞外泌體miRNA 表達(dá)譜存在很多差異，其中miR-17-5p在HCC827/G 細(xì)胞中表達(dá)升高，提示其可能與吉非替尼耐藥相關(guān)［5］。近來(lái)研究表明miR-17-5p 是一種癌基因，促進(jìn)了多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［6］。因此該研究擬證實(shí)miR-17-5p 介導(dǎo)NSCLC 吉非替尼耐藥的作用并探討其可能機(jī)制，旨在尋找新的耐藥靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HCC827 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，HCC827/G 細(xì)胞為前期通過(guò)低濃度吉非替尼持續(xù)誘導(dǎo)HCC827 細(xì)胞構(gòu)建。吉非替尼治療前血清4 例與治療耐藥后血清3 例均收集自2016年至2017年間廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院確診的NSCLC 患者，其中男3 例，女4 例，年齡57 ～81 歲。

1.2 試劑和儀器 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自BI。吉非替尼購(gòu)自MCE。QRT-PCR 試劑購(gòu)自TaKaRa。miR-17-5p 相關(guān)引物、mimics 和inhibitor、PTEN shRNA、PTEN 3′UTR 區(qū)雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒均購(gòu)自復(fù)能。PTEN 抗體購(gòu)自CST。lipo2000購(gòu)自Thermo。凋亡檢測(cè)試劑購(gòu)自聯(lián)科。熒光定量PCR儀購(gòu)自伯樂(lè)。流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞使用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，3 d 傳代一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 QRT-PCR 依說(shuō)明書(shū)提取樣品RNA，測(cè)濃度后取1 μg 轉(zhuǎn)錄為cDNA。以U6 或β-actin 作為內(nèi)參，設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。引物：人β-actin：F：ATGATGATATCGCCGCGCTC，R：CCACCATCACGCCCTGG；人PTEN：F：TCCCAGACATGACAGCCATC，R：GCTTTGAATCCAAAAACCTTACTAC。U6、miR-17-5p 引物序列復(fù)能公司未提供。反應(yīng)條件：95 ℃10 min；95 ℃10 s、60 ℃20 s（采集熒光）、72 ℃10 s，45 個(gè)循環(huán)；融解曲線(xiàn)分析。利用2-△△CT法計(jì)算各指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 依據(jù)lipo2000 說(shuō)明書(shū)步驟完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染，QRT-PCR與Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.3.4 MTS 實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種96 孔板，待細(xì)胞貼壁后各孔中分別加入梯度濃度吉非替尼，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后每孔加入20 μL MTS 試劑，測(cè)OD 值后繪制藥敏曲線(xiàn)并計(jì)算IC50值。

1.3.5 細(xì)胞凋亡分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入低濃度吉非替尼作用12 h 后，依說(shuō)明書(shū)步驟將細(xì)胞染色后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果使用FlowJo 7.6軟件分析。

1.3.6 Western Blot 檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞提取總蛋白。BCA 法測(cè)定蛋白濃度后取20 μg 蛋白行SDS-PAGE 電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜、封閉，然后一抗4 ℃孵育過(guò)夜，次日孵二抗后曝光顯影。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將miR-17-5p mimics 分別與對(duì)照質(zhì)粒和PTEN3′UTR 區(qū)雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染12 孔板中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T 細(xì)胞，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，72 h 后取上清檢測(cè)熒光素酶活性，以GLUC 為報(bào)告基因、SEAP 為對(duì)照基因，計(jì)算對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)熒光素酶活性。

1.3.8 生物信息學(xué)分析 利用Targetscan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-17-5p 的靶基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-17-5p 在耐藥HCC827/G 細(xì)胞中表達(dá)增高 QRT-PCR 結(jié)果顯示miR-17-5p在耐藥HCC827/G 細(xì)胞中表達(dá)增高，與前期二代測(cè)序結(jié)果相符，提示miR-17-5p 可能參與介導(dǎo)吉非替尼耐藥（圖1）。

圖1 miR-17-5p 在HCC827 和HCC827/G 細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-17-5p in HCC827 and HCC827/G cells

2.2 miR-17-5p 介導(dǎo)了HCC827/G 細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥 HCC827 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-17-5p 后（圖2A），細(xì)胞對(duì)吉非替尼的IC50值為（27.48±4.04）μmol/L，較對(duì)照組的（2.70 ± 0.86）μmol/L 明顯增高（圖2B），提示細(xì)胞耐藥性增加。在HCC827/G 細(xì)胞中敲低miR-17-5p 后（圖2C），25 μmol/L 吉非替尼對(duì)細(xì)胞的相對(duì)抑制率較對(duì)照組明顯增加（圖2D），提示細(xì)胞耐藥性降低。表明miR-17-5p 介導(dǎo)了HCC827/G 細(xì)胞的吉非替尼耐藥。

圖2 HCC827 和HCC827/G 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-17-5p mimics 和inhibitor 后的耐藥性變化Fig.2 Changes of drug resistance after HCC827 and HCC827/G cells transfected with miR-17-5p mimics and inhibitor，respectively

2.3 miR-17-5p 抑制了吉非替尼誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡 HCC827 過(guò)表達(dá)miR-17-5p 后，細(xì)胞凋亡率較對(duì)照明顯減少（圖3A）。HCC827/G 敲低miR-17-5p 后，細(xì)胞凋亡率較對(duì)照明顯增加（圖3B）。表明miR-17-5p 可降低吉非替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果。

圖3 HCC827 和HCC827/G 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-17-5p mimics 和inhibitor 后的細(xì)胞凋亡變化Fig.3 Apoptosis of HCC827 and HCC827/G cells transfected with miR-17-5p mimics and inhibitor，respectively

2.4 miR-17-5p靶向抑制PTEN介導(dǎo)HCC827/G細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥 生信分析預(yù)測(cè)到PTEN 為miR-17-5p 的靶基因（圖4A）。QRT-PCR 與Western Blot 結(jié)果均顯示PTEN 在HCC827/G 中的表達(dá)較HCC827 明顯降低（圖4B、4C）。當(dāng)HCC827 過(guò)表達(dá)miR-17-5p 后，PTEN 表達(dá)明顯下調(diào)（圖4D、4E）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入miR-17-5p mimics 后，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)熒光素酶活性較對(duì)照組明顯下降（圖4F）。提示miR-17-5p 可靶向抑制PTEN 基因的表達(dá)。

在HCC827 中敲低PTEN 后（圖4G），3.13μM吉非替尼對(duì)細(xì)胞的相對(duì)抑制率較對(duì)照組明顯降低（圖4H），提示PTEN 參與介導(dǎo)吉非替尼耐藥。進(jìn)一步功能阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同時(shí)敲低PTEN 可逆轉(zhuǎn)單獨(dú)敲低HCC827/G 的miR-17-5p 表達(dá)導(dǎo)致的吉非替尼耐藥性降低（圖4I）。以上結(jié)果表明miR-17-5p 通過(guò)靶向抑制PTEN 介導(dǎo)了HCC827/G 細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥。

圖4 miR-17-5p 靶向抑制PTEN 介導(dǎo)HCC827/G 細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥Fig.4 miR-17-5p mediated HCC827/G cell resistance to gefitinib by inhibiting the expression of PTEN

2.5 吉非替尼耐藥后NSCLC 患者血清miR-17-5p表達(dá)水平升高 QRT-PCR結(jié)果顯示3例吉非替尼耐藥后NSCLC患者血清中miR-17-5p的表達(dá)水平明顯高于4 例吉非替尼治療前NSCLC 患者。見(jiàn)圖5。

3 討論

圖5 吉非替尼耐藥后NSCLC 患者血清中miR-17-5p 表達(dá)水平的變化Fig.5 Changes of serum miR-17-5p expression in NSCLC patients of gefitinib resistance

NSCLC 約占肺癌的80% ～85%且發(fā)現(xiàn)時(shí)大多患者已處于晚期而失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，化療是其最主要的全身治療方式，但是明顯的毒副作用限制了化療在晚期NSCLC 治療中的作用。近年研究證明［7］，使用EGFR-TKI 靶向治療EGFR 基因突變型NSCLC 可獲得較化療更好的療效且毒副作用小，因此其已成為另一種重要的NSCLC 全身治療方式。吉非替尼為EGFR-TKI 的代表性藥物。然而，大部分NSCLC 的EGFR-TKI 靶向治療會(huì)在12個(gè)月左右出現(xiàn)耐藥，這嚴(yán)重影響了其臨床應(yīng)用［8］。目前已發(fā)現(xiàn)的耐藥機(jī)制主要包括三個(gè)方面［8］：（1）二次EGFR 基因突變，如T790M 突變；（2）下游旁路信號(hào)途徑激活，如Kras 基因突變、MET 擴(kuò)增等；（3）組織學(xué)類(lèi)型的轉(zhuǎn)化，如NSCLC 轉(zhuǎn)化為小細(xì)胞肺癌等。但仍有近30%的患者耐藥機(jī)制不明。因此，進(jìn)一步尋找EGFR-TKI 耐藥靶標(biāo)并闡明其耐藥機(jī)制對(duì)于逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI 耐藥具有重要意義。

HCC827 是EGFR 基因19del 突變且對(duì)吉非替尼敏感的人NSCLC 細(xì)胞株。該研究前期不僅成功構(gòu)建了吉非替尼繼發(fā)耐藥細(xì)胞株HCC827/G，而且還排除了目前已知的主要耐藥機(jī)制在HCC827/G吉非替尼耐藥中的作用［5］。提示HCC827/G 中還存在著新的吉非替尼耐藥機(jī)制。通過(guò)分析外泌體二代測(cè)序結(jié)果，該研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p 在HCC827/G外泌體中的含量增加，進(jìn)一步QRT-PCR 實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-17-5p在HCC827/G細(xì)胞中的表達(dá)也增加，提示miR-17-5p可能介導(dǎo)了HCC827/G的吉非替尼耐藥。

miR-17-5p 屬于miR-17-92 miRNA 簇。有研究［9］報(bào)道m(xù)iR-17-92 miRNA 簇在多種腫瘤中發(fā)揮了癌基因的作用，miR-17-92 miRNA 簇的過(guò)表達(dá)是關(guān)鍵致癌事件。CHEN 等［10］研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p在81 例鼻咽癌患者腫瘤組織中高表達(dá)，且高表達(dá)miR-17-5p 患者的總生存時(shí)間較低表達(dá)患者明顯縮短。宋先璐等［11］報(bào)道m(xù)iR-17-5p、miR-92a 和let-7b 在順鉑耐藥NSCLC 細(xì)胞株中表達(dá)升高，該組miRNA 通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖介導(dǎo)了NSCLC 的順鉑耐藥。以上研究表明miR-17-5p 在多種腫瘤中發(fā)揮了癌基因的作用，miR-17-5p 參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及化療耐藥等生物學(xué)過(guò)程。然而關(guān)于miR-17-5p 與非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI靶向治療耐藥的相關(guān)研究報(bào)道尚未見(jiàn)報(bào)道，該研究首次發(fā)現(xiàn)miR-17-5p參與介導(dǎo)了非小細(xì)胞肺癌的EGFR-TKI 靶向治療耐藥。BOBBILI 等［12］報(bào)道m(xù)iR-17-5p 可以通過(guò)外泌體和細(xì)胞外囊泡的形式向細(xì)胞外釋放以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的通訊并執(zhí)行相關(guān)生物學(xué)功能。該研究前期就以吉非替尼敏感和耐藥細(xì)胞的外泌體作為研究對(duì)象，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)了miR-17-5p在耐藥細(xì)胞外泌體中的高表達(dá)狀態(tài)。然后該研究進(jìn)一步通過(guò)QRT-PCR證實(shí)了miR-17-5p在耐藥細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)狀態(tài)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在敏感的HCC827 細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-17-5p mimics 后細(xì)胞對(duì)吉非替尼的IC50值明顯增加且細(xì)胞凋亡率降低，而耐藥的HCC827/AR 細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-17-5p inhibitor 后吉非替尼對(duì)細(xì)胞的抑制率明顯增加且細(xì)胞凋亡率增加，這從正反兩個(gè)方面證實(shí)miR-17-5p 介導(dǎo)了NSCLC的吉非替尼耐藥，且該過(guò)程可能是通過(guò)miR-17-5p靶向調(diào)控凋亡相關(guān)基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

BOBBILI 等［12］綜述了已有報(bào)道的miR-17 靶基因，其中與凋亡調(diào)控相關(guān)的基因有PTEN 與P21等。該研究通過(guò)生物信息學(xué)分析也預(yù)測(cè)到了PTEN 為miR-17-5p 的下游靶基因。因此該研究將凋亡相關(guān)基因PTEN 選為miR-17-5p 下游靶基因的候選基因進(jìn)行下一步研究。相關(guān)研究［13］報(bào)道多種腫瘤中PTEN 基因的缺失或突變可導(dǎo)致PTEN 表達(dá)的缺失或下調(diào)，而作為負(fù)性調(diào)控因子，PTEN 表達(dá)的缺失或下調(diào)可通過(guò)激活PI3K/Akt 信號(hào)通路來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)其增殖，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。該研究顯示，PTEN 在吉非替尼耐藥細(xì)胞株HCC827/G 中表達(dá)下調(diào)，而在PTEN 高表達(dá)的敏感細(xì)胞HCC827 中轉(zhuǎn)入miR-17-5p mimics后PTEN表達(dá)也明顯下調(diào)。同時(shí)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也證實(shí)了miR-17-5p 對(duì)PTEN 表達(dá)的抑制作用。此外該研究還通過(guò)在吉非替尼敏感HCC827 細(xì)胞中敲低PTEN 后檢測(cè)到吉非替尼對(duì)細(xì)胞的相對(duì)抑制率降低和功能阻斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PTEN 參與了HCC827/G 細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥。而這些結(jié)果均表明miR-17-5p 可通過(guò)靶向抑制PTEN 基因表達(dá)介導(dǎo)HCC827/G 細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥。

最后，該研究還發(fā)現(xiàn)在吉非替尼耐藥后的NSCLC 患者血清中的miR-17-5p 表達(dá)水平較治療前升高，提示miR-17-5p 還有望作為耐藥監(jiān)測(cè)的指標(biāo)之一。但由于耐藥監(jiān)測(cè)以及標(biāo)本二次取樣困難等原因?qū)е略撗芯克占臉悠窋?shù)量偏少，這是該研究的不足，因此該研究下一步擬繼續(xù)收集耐藥后的臨床樣品以完成后續(xù)的更大樣品量的臨床驗(yàn)證工作。

綜上所述，miR-17-5p 通過(guò)靶向下調(diào)PTEN 基因表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥，其有望成為吉非替尼耐藥新靶點(diǎn)。