番杏TtASR基因的克隆及其抗逆功能分析

葉玉妍 羅鳴 陳紅鋒 張美 何金實(shí) 楊禮香

摘? 要? ASR（ABA， Stress and Ripening）蛋白是植物中特有的親水性小分子蛋白，在植物細(xì)胞失水條件下對(duì)細(xì)胞器起保護(hù)性作用。本研究在構(gòu)建番杏[Tetragonia tetragonioides （Pall.） Kuntze]全長cDNA文庫中通過隨機(jī)克隆測(cè)序分析基礎(chǔ)上，獲得了一個(gè)編碼番杏ASR蛋白的全長cDNA序列，命名為TtASR（GenBank登錄號(hào)：MH454101）。TtASR的cDNA全長序列包含一個(gè)為723 bp完整開放閱讀框，編碼蛋白TtASR含有240個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5.26，分子量為25.29 ku。對(duì)TtASR與其他植物中同源蛋白的進(jìn)化分析表明，與遼寧堿蓬SlASR和海蓬子SbASR-1親緣關(guān)系較近。將TtASR的cDNA閱讀框插入到原核表達(dá)載體pGEX 6p-1中，通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)分析。結(jié)果表明，重組大腸桿菌菌株能表現(xiàn)出良好地抗逆性，特別是對(duì)NaCl、高滲透壓和氧化脅迫的抗逆性增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞? 番杏;ASR基因;逆境脅迫

中圖分類號(hào)? Q949.745.5? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

Abstract? ABA， stress and ripening （ASR） protein belongs to a plant-specific small family of proteins with low molecular weight and high hydrophobicity， and is supposed to play protective roles in plant cells under abiotic stresses. An ASR gene， designated as TtASR （GenBank accession no.： MH454101）， was isolated from a cDNA library prepared from Tetragonia tetragonioides （Pall.） Kuntze and both the nucleotide and the deduced protein sequences were analyzed. The full length cDNA of TtASR contained a 723 bp long open reading frame， which would encode a peptide of 240 amino acid residues with a molecular weight of 25.29 ku and an isoelectric point of 5.26. TtASR shared a high amino acid sequence homology with the ASRs from Suaeda liaotungensis （SlASR） and Salicornia brachiata （SbASR-1）. The open reading frame of TtASR was inserted into the prokaryotic expression vector of pGEX 6p-1 and transformed into E. coli. The E. coli cells under the induction of IPTG showed higher tolerance to NaCl， osmotic stress and oxidative stress than control cells.

Keywords? Tetragonia tetragonioides （Pall.） Kuntze; ASR gene; abiotic stress

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.011

番杏[Tetragonia tetragonioides （Pall.） Kuntze]又名新西蘭菠菜、野菠菜、洋菠菜、白番莧，為番杏科番杏屬一年生或二年生半蔓性草本植物，分布于亞熱帶及溫帶地區(qū)的濱海富鹽區(qū)域，是一種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值的鹽生蔬菜[1–3]。番杏營養(yǎng)價(jià)值高，富含礦物質(zhì)及多種維生素，營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)莖葉鮮嫩，口味清爽。番杏可全株入藥，有清熱、解毒的功效，對(duì)消化道癌癥有一定的緩解和治療作用[3]。番杏全株還含有抗菌的番杏素，是近幾年我國新興的一種很受人們歡迎的新型保健型蔬菜[2]。此外，番杏作為一種高耐鹽性的鹽土植物（halophyte），可耐受海水鹽度，在海水倒灌引起的鹽滯地區(qū)可正常生長，可用于對(duì)濱海灘涂地、鹽荒地、海水倒灌農(nóng)田改良和利用，是一種具有重要生態(tài)價(jià)值的經(jīng)濟(jì)作物[3-4]。

鹽土植物是挖掘耐鹽遺傳資源、分離耐鹽基因和啟動(dòng)子的重要來源[5]。土壤鹽漬化是我國農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境退化的重要問題之一，嚴(yán)重影響我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。土壤鹽漬化不僅影響土壤的利用率及農(nóng)作物的種植面積，還會(huì)引起農(nóng)作物營養(yǎng)缺陷和產(chǎn)量下降[6]。通過植物遺傳改良提高作物的耐鹽性是現(xiàn)代植物分子育種的重要手段，而通過分子生物學(xué)手段發(fā)掘耐鹽基因是不可或缺的工作基礎(chǔ)。植物的耐鹽分子機(jī)理可歸納為3種類型：離子外排、滲透壓耐受和組織耐受[7];或者總結(jié)為兩類耐受機(jī)制：滲透壓耐受和離子耐受[8]。研究表明，在上述不同的耐受機(jī)理中，有幾類關(guān)鍵的基因在提高植物耐鹽性方面發(fā)揮重要的作用，這些基因主要通過介導(dǎo)Na+/K+吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、外排，從而緩解離子毒害，提高植物細(xì)胞滲透脅迫的耐受性[8]。已經(jīng)鑒定的耐鹽功能基因主要包括離子通道蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、代謝酶類及一些保護(hù)性蛋白[9]。

ASR（ABA， stress and ripening）基因是植物中特有的一類主要參與調(diào)控細(xì)胞耐受水分缺失的抗逆基因，通常只含有較少的基因家族成員，且編碼高度親水的小分子蛋白[10]。該類基因在包括模式植物擬南芥在內(nèi)的十字花科植物中明顯缺失[11]。番茄Asr1基因是植物中首次克隆的ASR基因成員，參與調(diào)控番茄果實(shí)發(fā)育成熟及葉片應(yīng)答干旱脅迫及ABA處理等，之后又在番茄基因組中依次發(fā)現(xiàn)了4個(gè)ASR基因成員。番茄中該基因家族的不同成員因其表達(dá)的差異性可能參與調(diào)控不同組織和器官的抗逆應(yīng)答反應(yīng)[12]。目前已在多種植物中克隆獲得了ASR基因成員[10]，其編碼蛋白的典型特征為C端包含一個(gè)高度保守的ABA/WDS結(jié)構(gòu)域（ABA/water deficit stress domain; PF02496 in PFAM）[13]。研究表明，ASR蛋白不僅可以作為分子伴侶對(duì)細(xì)胞成分在缺水情況下行使保護(hù)作用，而且還可以作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控抗逆基因的表達(dá)，提高細(xì)胞抗逆能力[14]。

除了介導(dǎo)植物參與應(yīng)答干旱/水分缺失等脅迫外，ASR蛋白參與調(diào)控植物耐鹽應(yīng)答也受到了人們的重視。百合ASR基因LLA23能夠提高轉(zhuǎn)基因超表達(dá)擬南芥的耐鹽性[15];同樣，香蕉ASR基因MpAsr也能夠提高轉(zhuǎn)基因超表達(dá)擬南芥的耐鹽性和滲透壓脅迫耐受性[16];海蓬子（Salicornia brachiata）和遼寧堿蓬（Suaeda liaotungensis K.）均為生長于溫帶地區(qū)的濱海鹽生植物，具有高度的耐鹽性和耐旱性。海蓬子ASR基因成員SbASR和遼寧堿蓬A(yù)SR基因SlASR在煙草[17]、花生[18]和擬南芥[19]中超量表達(dá)均能夠提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性;農(nóng)作物小米（Setaria italica）ASR基因SiASR4的超量表達(dá)也能夠提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鹽旱脅迫的耐受性[20]。

迄今為止，有關(guān)鹽土植物番杏（T. tetragonioides）的耐鹽機(jī)理還未見報(bào)道，對(duì)其耐鹽基因TtASR的研究不僅有助于深入闡述鹽土植物的耐鹽機(jī)理，還能對(duì)提高植物耐鹽性的遺傳育種提供可操作候選基因。本研究從番杏的cDNA文庫中隨機(jī)測(cè)序獲得TtASR基因（GenBank登錄號(hào)：MH454101），并對(duì)其進(jìn)行序列分析和原核表達(dá)研究。

1? 材料與方法

1.1? 材料

番杏植株種植于于華南植物園育苗基地（23°18′75.91″N，113°37′02.38″E）。栽培條件為生長溫度25～35 ℃、相對(duì)濕度50%～90%、遮陰棚、自然光照時(shí)，可完成生長周期及收獲種子。番杏種子經(jīng)37 ℃萌發(fā)24 h后，種植于濕潤的蛭石中，置于恒溫培養(yǎng)室（25 ℃）中，約2個(gè)月可生長成番杏小苗。采用番杏幼苗全株構(gòu)建番杏cDNA文庫。

番杏DH10B大腸桿菌菌株cDNA文庫由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存;大腸桿菌（Escherichia coli）菌株JM109和BL21（DE3）、蛋白表達(dá)載體pGEX 6p-1均為本實(shí)驗(yàn)室保存。載體無縫克隆所用的In-Fusion HD Cloning Kit購于Clontech（TaKaRa Bio USA）公司。

1.2? 方法

1.2.1? 番杏文庫目標(biāo)克隆子TtASR的獲得? 將文庫菌液涂布LB培養(yǎng)基平板至生長出單克隆，隨機(jī)挑選文庫克隆，并采用堿裂解法提取質(zhì)粒，采用載體pYES-DEST52插入位點(diǎn)上游的通用引物T7（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）對(duì)獲得的番杏文庫單克隆質(zhì)粒中插入的cDNA序列進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序獲得的序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)。經(jīng)分析獲得一個(gè)編碼番杏ASR（ABA， stress and ripening）蛋白的cDNA全長，命名為

TtASR。

1.2.2? 序列的生物信息學(xué)分析? 根據(jù)番杏TtASR的氨基酸序列信息，采用SmartBLAST（https：// blast.ncbi.nlm.nih.gov/smartblast/？LINK_LOC=BlastHomeLink）查找NCBI數(shù)據(jù)庫中登陸的ASR蛋白同源序列。采用MEGA6中的Clustal W程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)并構(gòu)建Neighbor-joining analysis（分析重復(fù)數(shù)為1000）的進(jìn)化樹。參與構(gòu)建TtASR進(jìn)化樹的其他17種植物ASR成員信息如表1所示。

采用PHYRE2程序（http：//www.sbg.bio.ic. ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）分析TtASR蛋白無序度和三維結(jié)構(gòu)。TtASR的氨基酸含量，穩(wěn)定性和親水性等其他理化性質(zhì)采用ExPASy數(shù)據(jù)庫中的ProtParam程序（http：//web.expasy.org/ protparam/）進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3? 大腸桿菌蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建和蛋白的誘導(dǎo)? 以含有TtASR的cDNA的質(zhì)粒為模板，采用高保真DNA聚合酶ProbestTM DNA Polymerase擴(kuò)增番杏TtASR基因的閱讀框序列。所采用的引物為TtASREF（5′-GGGGCCCCTGGGATCCAT?GGCCGAAAGCCGTGACAG-3′）和TtASRER（5′-GGAATTCCGGGGATCCTTAAAAGAAGTGGTGCTTCT-3′），PCR反應(yīng)體積為50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10 × PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 4 μL，10 μmol/L TtASREF 1 μL，10 μmol/L TtASRER 1 μL，ProbestTM DNA Polymerase 0.5 μL，cDNA模板2 μL（10 ng/μL），ddH2O 36.5 μL。各種成分混勻后置于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s、56 ℃退火50 s、72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可獲得單一的DNA條帶（約750 bp），此即為PCR擴(kuò)增得到的TtASR基因的cDNA閱讀框片段。該DNA片段依照Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits說明書進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收。

大腸桿菌蛋白表達(dá)載體pGEX 6p-1經(jīng)BamHI單酶切處理，回收線性化載體?；厥誘tASR的PCR片段和線性化pGEX 6p-1載體經(jīng)NanoDrop公司紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，采用TaKaRa公司的In-Fusion? HD Cloning Kit進(jìn)行DNA片段和載體的同源重組連接。按照說明書的方法將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109（TaKaRa公司）感受態(tài)菌株。挑取單克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定為正確的陽性克隆后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌蛋白表達(dá)菌株BL21（DE3）。

挑取陽性克隆接種于3 mL含氨芐霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜至OD600為0.5～0.8，以1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600至0.5左右時(shí)，加IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)4 h。離心收集菌體，加入1/10體積的2SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。其中轉(zhuǎn)化空載體pGEX 6p-1的BL21（DE3）菌株作為對(duì)照。

1.2.4? 大腸桿菌表達(dá)TtASR蛋白對(duì)細(xì)菌抗逆性的影響? 取0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后的菌液（包括插入TtASR的pGEX6p-1和空載體pGEX6p-1對(duì)照），調(diào)整濃度為OD600約等于1，按照1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000將菌液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，分別吸取2 ?L逐級(jí)稀釋的菌液滴至添加有1% NaCl（對(duì)照，170 mmol/L NaCl）、3% NaCl（高鹽脅迫，510 mmol/L NaCl）和4% NaCl（高鹽脅迫，680 mmol/L NaCl）的LB培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG和0.1 μg/mL的氨芐抗生素）上，37 ℃培養(yǎng)12～36 h，觀察表達(dá)GST- TtASR蛋白的大腸桿菌耐鹽生長情況。

同樣，將上述菌液逐級(jí)稀釋后，分別吸取2 ?L菌液滴至添加有1、1.5 mol/L甘露醇以及2、4 mmol/L的H2O2的LB培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG和100 μg/mL的氨芐西林）上，37 ℃培養(yǎng)12～36 h，觀察表達(dá)GST-TtASR蛋白的大腸桿菌耐滲透壓和抗氧化生長情況。

2? 結(jié)果與分析

2.1? TtASR基因編碼一個(gè)富含甘氨酸的親水性固有無序蛋白

通過對(duì)番杏cDNA文庫單克隆的隨機(jī)測(cè)序，獲得一個(gè)編碼ASR蛋白的全長cDNA，命名為TtASR。TtASR共長1112 bp，其中5′非翻譯區(qū)為75 bp，3′非翻譯區(qū)為314 bp，編碼區(qū)長度為723 bp，編碼一個(gè)含有240氨基酸的ASR蛋白TtASR。TtASR的N端富含甘氨酸;而其靠近C端含有ASR蛋白共有的ABA和水分脅迫結(jié)構(gòu)域（ABA/WDS domain）;在C末端含有一個(gè)核定位序列NLS（nuclear localization signal），推測(cè)TtASR可能分布于細(xì)胞核。

采用PHYRE2程序分析TtASR的無序性，顯示84%的TtASR氨基酸序列為無序狀態(tài)，表明該蛋白為固有無序蛋白（intrinsically disordered protein，IDP）。

采用ProtParam程序分析TtASR的氨基酸成分及穩(wěn)定性和親水性，表明TtASR的理論分子量為25.29 ku，理論等電點(diǎn)為5.26。TtASR的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為30.51，是一個(gè)比較穩(wěn)定的蛋白分子。TtASR的總平均親水指數(shù)（GRAVY）為?1.369，屬于高度親水性蛋白（<0）。如表2所示，TtASR富含中性氨基酸Gly（G，21.25%）;親水性氨基酸Glu（E，15%），Ser（S，7.08%）和Thr（T，10.42%）含量也較高;而疏水性氨基酸Ile（I，0.83%），Leu（L，1.67%），Met（M，0.42%），Phe（F，2.5%），Pro（P，1.25%）和Val（V，1.25%）含量較低。Trp（W）和Cys（C）2種氨基酸含量為0。

2.2? TtASR編碼氨基酸序列的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

經(jīng)MEGA6中的Clustal W程序分析，TtASR的與菠蘿AcASR（XP_020111424.1）和野生馬鈴薯ScASR（AAA86052.1）2個(gè)ASR蛋白的進(jìn)化關(guān)系較近。構(gòu)建TtASR與其他17種植物的ASR氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明番杏TtASR與濱海植物海蓬子SbASR-1（ACI15208.1）和遼寧堿蓬SlASR（AGZ20206.1），以及耐旱作物藜麥CqASR（XP_021771569.1）和菠菜SoASR（KNA25755.1）也具有較高的同源性。

2.3? GST-TtASR融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定為陽性的含有TtASR-pGEX 6p-1重組質(zhì)粒的BL21（DE3）菌體經(jīng)過終濃度為0.2 mmol/L的IPTG分別誘導(dǎo)不同時(shí)間。將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果表明在誘導(dǎo)4 h后出現(xiàn)一條明顯的誘導(dǎo)蛋白帶，與預(yù)期大核苷酸序列上的2個(gè)方框分別是翻譯起始密碼子ATG和終止密碼子TAA。蛋白質(zhì)序列上的2個(gè)方框分別是ABA和水分脅迫結(jié)構(gòu)域（ABA/WDS domain），雙向細(xì)胞核定位信號(hào)NLS（Nuclear localization signal）。

小一致（GST-TtASR融合蛋白，約53 ku），而轉(zhuǎn)化pGEX 6p-1空載體的BL21（DE3）菌體在誘導(dǎo)4 h后在27 ku位置出現(xiàn)的明顯的GST誘導(dǎo)條帶，二者的分子量差別約為25 ku，與TtASR預(yù)測(cè)的分子量大小一致，表明帶有GST標(biāo)簽的TtASR蛋白在大腸桿菌中得到了正確的表達(dá)，且在IPTG誘導(dǎo)4 h具備較大的表達(dá)量。

2.4? TtASR蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)能夠提高細(xì)菌對(duì)高鹽、滲透壓和氧化脅迫的耐受性

誘導(dǎo)表達(dá)GST-TtASR的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌相比較于轉(zhuǎn)化空載體pGEX 6p-1的大腸桿菌而言，能夠在添加3%、4% NaCl的高鹽培養(yǎng)基平板上生長，也能在添加1、1.5mol/L甘露醇的LB培養(yǎng)基平板上生長;而單獨(dú)表達(dá)GST的大腸桿菌（轉(zhuǎn)化空載體pGEX 6p-1）則幾乎不能生長，表明TtASR蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)能夠提高細(xì)菌對(duì)高鹽和高滲透壓脅迫的耐受性。同樣，誘導(dǎo)表達(dá)GST-TtASR的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌相比較于轉(zhuǎn)化空載體pGEX 6p-1的大腸桿菌而言，能夠在添加2 mmol/L H2O2的LB培養(yǎng)基平板上生長，且生長狀況良好，而在添加4 mmol/L H2O2的LB培養(yǎng)基平板上也可以較好生長;而單獨(dú)表達(dá)GST的大腸桿菌（轉(zhuǎn)化空載體pGEX 6p-1）則生長受到輕微抑制，表明TtASR蛋白的表達(dá)能夠提高大腸桿菌對(duì)氧化脅迫的耐受性。

3? 討論

植物在生長發(fā)育過程中，通常會(huì)遭遇多種逆境脅迫并對(duì)生長產(chǎn)生不利的影響，而高鹽、干旱以及冷凍造成的細(xì)胞內(nèi)水分缺失是常見的逆境脅迫。植物在適應(yīng)這些逆境的長期進(jìn)化過程中，發(fā)展了一系列的生理及分子機(jī)制減緩逆境對(duì)其自身生長發(fā)育的傷害，并維持植物體完成正常的生長周期和世代交替。鹽生植物可在高鹽環(huán)境下正常生長并完成其生活周期，是因其長期適應(yīng)環(huán)境中高鹽、高滲透壓的缺水環(huán)境，在體內(nèi)產(chǎn)生了獨(dú)特的細(xì)胞內(nèi)抗逆機(jī)制[21]，故而是耐鹽功能基因及啟動(dòng)子的重要來源[5]。

番杏是一種鹽生型保健蔬菜，可在海水倒灌的高鹽地區(qū)生長并改良土壤[1， 3]。本研究從番杏中挖掘了一個(gè)耐鹽功能基因TtASR。序列分析表明，TtASR蛋白除了含有ASR蛋白高度保守的ABA/WDS結(jié)構(gòu)域外，還有一個(gè)明顯的特征是富含甘氨酸（G，glycine，21.25%）。進(jìn)化樹分析表明，另外2個(gè)鹽生植物的ASR成員SlASR（AGZ20206.1）和SbASR-1（ACI15208.1）也富含甘氨酸，含量分別為24.47%和25.25%。已有研究報(bào)道，SlASR和SbASR-1均可以提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性[17-19]，表明這兩者均為植物耐鹽功能基因。本研究中，序列同源性分析及在大腸桿菌中的功能初步分析表明，TtASR基因也可能是番杏體內(nèi)重要的耐鹽功能基因。

植物富含甘氨酸的蛋白（glycine-rich protein，GRP）構(gòu)成了植物體內(nèi)重要的一類抗逆功能蛋白超家族，參與調(diào)控植物應(yīng)答溫度脅迫、高鹽、干旱、滲透壓以及機(jī)械傷害和生物脅迫的多重反應(yīng)[22-23]。植物GRP基因參與調(diào)控鹽旱及氧化脅迫已在多個(gè)物種中得到了驗(yàn)證[22]。擬南芥AtGRP2和AtGRP4均提高轉(zhuǎn)基因超表達(dá)植株的耐鹽性[24]。煙草NtGR-RBP1在大腸桿菌中表達(dá)提高細(xì)菌對(duì)高鹽、高溫和高滲透壓的耐受性[25]。小立碗蘚（Physcomitrella patens）的GRP型脫水素基因PpDHNA參與小立碗蘚調(diào)控細(xì)胞的耐鹽耐旱性[26]。考慮番杏TtASR具有植物GRP蛋白的特征，以及含有ABA/WDS結(jié)構(gòu)域，且能提高大腸桿菌的耐鹽耐旱能力，我們可以進(jìn)一步推斷番杏TtASR基因可以提高植物對(duì)鹽旱脅迫的耐受性，相關(guān)的植物方面的功能研究以及轉(zhuǎn)TtASR基因作物能否成功用于抗逆育種并有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

賴正鋒， 李華東. 番杏的生物學(xué)特征及其栽培新技術(shù)[J]. 福建熱作科技， 2007， 32（3）： 22， 46.

林更銘， 駱建寧， 項(xiàng)? 鵬. 利用冬閑海水養(yǎng)殖池塘種植番杏的初步探討[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊， 2014， 11： 117-119.

王? 蕾， 吳朝波， 徐微風(fēng)， 等. 海水脅迫對(duì)番杏生長、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和細(xì)胞膜透性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 44（7）： 248-251.

Wilson C， Lesch S M， Grieve C M. Growth stage modulates salinity tolerance of New Zealand spinach （Tetragonia tetragonioides， Pall.） and red orach （Atriplex hortensis L.）[J]. Annals of Botany， 2000， 85： 501-509.

Mishra A， Tanna B. Halophytes： potential resources for salt stress tolerance genes and promoters[J]. Frontiers in Plant Science， 2017， 8： 829.

王永泰. 鹽土植物和鹽土改良[J]. 生物學(xué)通報(bào)， 1991， 6： 12-17.

Roy S J， Negr?o S， Tester M. Salt resistant crop plants[J]. Current Opinion in Biotechnology， 2014， 26： 115-124.

Munns R， Tester M. Mechanisms of salinity tolerance[J]. Annual Review of Plant Biology， 2008， 59： 651-681.

Zhu J K. Salt and drought stress signal transduction in plants[J]. Annual Review of Plant Biology， 2002， 53： 247-273.

González R M， Iusem N D. Twenty years of research on Asr （ABA-stress-ripening） genes and proteins[J]. Planta， 2014， 239： 941-949.

Frankel N， Carrari F， Hasson E， et al. Evolutionary history of the Asr gene family[J]. Gene， 2006， 378： 74-83.

Golan I， Dominguez P G， Konrad Z， et al. Tomato abscisic acid stress ripening （ASR） gene family revisited[J]. PLoS ONE， 2014， 9： e107117.

Canel C， Bailey-Serres J N， Roose M L. Pummelo fruit transcript homologous to ripening-induced genes[J]. Plant Physiology， 1995， 108： 323-1324.

Dominguez P G， Carrari F. ASR1 transcription factor and its role in metabolism[J]. Plant Signaling & Behavior， 2015， 10： e992751.

Yang C Y， Chen Y C， Jauh G Y， et al. A Lily ASR protein involves abscisic acid signaling and confers drought and salt resistance in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2005， 139（2）： 836-846.

Dai J R， Liu B， Feng D R， et al. MpAsr encodes an intrinsically unstructured protein and enhances osmotic tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Cell Reports， 2011， 30： 1219-1230.

Jha B， Lal S， Tiwari V， et al. The SbASR-1 gene cloned from an extreme halophyte Salicornia brachiata enhances salt tolerance in transgenic tobacco[J]. Mar Biotechnol（NY）， 2012， 14（6）： 782-792.

Tiwari V， Chaturvedi A K， Mishra A， et al. Introgression of the SbASR-1 gene cloned from a halophyte Salicornia brachiate enhances salinity and drought endurance in transgenic groundnut （Arachis hypogaea） and acts as a transcription factor[J]. PLoS ONE， 2015， 10： e0131567.

Hu Y X， Yang X， Li X L， et al. The SlASR gene cloned from the extreme halophyte Suaeda liaotungensis K. enhances abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana[J]. Gene， 2014， 549： 243-251.

Li J， Dong Y， Li C， et al. SiASR4， the target gene of SiARDP from Setaria italica， improves abiotic stress adaption in plants[J]. Frontiers in Plant Science， 2017， 7： 2053.

Glenn E P， Brown J J， Blumwald E. Salt tolerance and crop potential of halophytes[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 1999， 18： 227-255.

Czolpinska M， Rurek M. Plant glycine-rich proteins in stress response： an emerging， still prospective story[J]. Frontiers in Plant Science， 2018， 9： 2.

Mangeon A， Junqueira R M， Sachetto-Martins G. Functional diversity of the plant glycine-rich proteins superfamily[J]. Plant Signaling & Behavior， 2010， 5（2）： 99-104.

Kim Y O， Pan S， Jung C H， et al. A zinc finger-containing glycine-rich RNA-binding protein， atRZ-1a， has a negative impact on seed germination and seedling growth of Arabidopsis thaliana under salt or drought stress conditions[J]. Plant Cell and Physiology， 2007， 48（8）： 1170-1181.

Jabeen B， Naqvi SM， Mahmood T， et al. Ectopic expression of plant RNA chaperone offering multiple stress tolerance in E. coli[J]. Molecular Biotechnology， 2017， 59（2-3）： 66-72.

Saavedra L， Svensson J， Carballo V， et al. A dehydrin gene in Physcomitrella patens is required for salt and osmotic stress tolerance[J]. The Plant Journal， 2006， 45（2）： 237-249.