骨橋蛋白與草酸鈣結石形成的關系研究進展

周威 黃群 孟冬冬

【關鍵詞】 OPN;草酸鈣;結石;發(fā)病機制

中圖分類號：R195 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.04.018

泌尿系結石發(fā)病率在人群中居高不下，歐美地區(qū)調(diào)查研究顯示， 5%～10%的人一生中至少發(fā)生1次泌尿系結石[1]。我國泌尿系結石平均發(fā)病率達到6.5%，南方地區(qū)更高，達到11.6%[2]。近年來，國內(nèi)泌尿系結石的發(fā)病率呈上升趨勢，并且經(jīng)治療后5年內(nèi)復發(fā)率在50.0%以上[3]。尿路結石以草酸鈣結石及其混合成分為主要類型。骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）在體外能抑制草酸鈣晶體的成核、生長和聚集，但在體內(nèi)能促進草酸鈣結石形成。現(xiàn)從OPN的結構、功能、與草酸鈣結石的關系等方面做一概述。

1 骨橋蛋白概述及其結構特性

骨橋蛋白又名分泌性磷蛋白-1（SSP1），是一種可溶性蛋白質(zhì)，存在于大多數(shù)體液中[4]，是由314個氨基酸組成的帶負電荷的磷酸化糖蛋白，分子量為35 kDa。SPP1基因編碼了OPN的五個不同亞型，其中OPN-a、OPN-b和OPN-c均由幾個高度保守的結構域組成，主要包括RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）、識別序列 （GRGDS）、SVVYGLR序列、凝血酶切割位點（RSK）、N-末端富含天冬氨酸序列、鈣結合位點和C-末端結合肝素結構域，其不同之處在于每種亞型在信號肽和天冬氨酸結構域之間的連接長度均不同[5]。OPN首先在骨中被發(fā)現(xiàn)，隨后在胎盤、泌尿生殖道等部位及血液、乳汁等體液中也發(fā)現(xiàn)有OPN存在。

骨橋蛋白能發(fā)揮其生物學活性，是由于其分子內(nèi)部含有兩個鈣結合區(qū)域、一個RGD序列與一個凝血酶裂解位點。其中，鈣結合區(qū)域在鈣離子介導或參與的反應過程中起重要作用，而后兩者可以促進細胞黏附。RGD序列通過整合素介導參與晶體黏附于上皮細胞、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導等過程[6]。而OPN被凝血酶片段裂解后，隱藏的整合素連接位點162SLAYGLR168暴露，繼而結合整合蛋白α4β1和α9β1[7]。作為細胞黏附蛋白和細胞因子，OPN通過與αvβ3-整合素和CD44的相互作用進一步介導細胞信號轉(zhuǎn)導[8]。

2 骨橋蛋白的調(diào)節(jié)及其功能

骨橋蛋白在體內(nèi)的表達受多種物質(zhì)調(diào)節(jié)。一水草酸鈣（COM）在尿路結石中占比最高，也是重要的OPN 調(diào)節(jié)因素。研究表明，OPN可促進體外培養(yǎng)的BSC-1 細胞表達OPN[9]。Yan等[10]發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)手術切除甲狀腺后，不同濃度和時間梯度的促甲狀腺素刺激會增加OPN的表達。Bouleftour等[11]研究發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺激素可促進小鼠OPN的表達。彭秀梅[12]在研究激素對牦牛OPN表達的影響時發(fā)現(xiàn)，黃體酮可明顯促進牦牛輸卵管上皮細胞骨橋蛋白表達，并且呈計量依賴性，而雌二醇則明顯抑制OPN的表達。鞠華龍等[13]在研究生長激素對大鼠OPN表達的影響時發(fā)現(xiàn)，應用生長激素后，大鼠正畸牙齒移動時牙周組織中OPN的表達也受影響。結扎大鼠單側輸尿管24 h后，OPN和OPN mRNA 的表達量升高4倍，說明物理刺激可以影響OPN mRNA的表達。此外，維素生K3、維生素D3、骨化三醇也能促進OPN的合成與分泌。OPN是一種存在于大多數(shù)體液中具有多種功能的蛋白質(zhì)，它主要的功能有：①細胞黏附，OPN能通過特定的依賴性RGD序列和非依賴性RGD序列結合細胞表面的整合蛋白受體，繼而發(fā)揮細胞黏附作用;②細胞募集，OPN能指導成纖維細胞的遷移;③細胞因子表達，OPN-CD44的相互作用刺激IL-12產(chǎn)生免疫球蛋白，也能抑制IL-10和IL-4的表達[14];④與腫瘤發(fā)展相關，在實體器官腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌等，OPN可以促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移，通過自體吞噬的上調(diào)來增強化學抗性從而介導腫瘤化療耐藥性[15];⑤礦化作用，F(xiàn)oster等[16]研究發(fā)現(xiàn)OPN具有調(diào)節(jié)牙本質(zhì)和骨的形成和礦化的非冗余作用;⑥細胞免疫，OPN調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)，以與TH-1類似的方式起作用，促進細胞介導的免疫應答[17]。此外，OPN還可以抑制脂肪細胞分化，也能通過與整合αvβ1相互作用促進間充質(zhì)干細胞的成骨分化，參與骨吸收，加速血管生成。

3 骨橋蛋白與草酸

體外實驗證明，高濃度草酸能通過增加細胞膜的通透性、促進細胞DNA斷裂等方式使細胞數(shù)量減少，它能對腎小管上皮細胞產(chǎn)生毒性作用，主要表現(xiàn)在以下2個方面：①促進UPTF1（凝血酶原片段1）的mRNA翻譯成UPTF1蛋白，從而介導急性炎癥反應，損傷腎上皮細胞，使腎小管上皮細胞凋亡和壞死;②對腎上皮細胞的毒性反應，包括改變細胞膜表面特性和細胞脂質(zhì)、破壞線粒體功能、改變細胞基因表達、產(chǎn)生大量的活性氧簇，進一步激活各種信號分子和轉(zhuǎn)錄因子，最終導致尿液中某些大分子物質(zhì)在腎小管上皮細胞中的表達上調(diào)[18]。目前認為腎上皮細胞損傷是結石形成的始動因素，隨著尿液草酸濃度的增加，草酸鈣結晶增加，草酸鈣晶體沉積能直接增加OPN的表達。正常情況下，OPN的表達局限在Henle環(huán)和腎乳頭表面上皮細胞，而在高草酸尿環(huán)境中，OPN表達增加，但仍主要局限于髓袢細段的基底膜間質(zhì)中。然而，在草酸鈣結晶聚集、沉積后，OPN在近端小管甚至整個腎臟中均有表達[19]。關曉峰等[20]通過乙二醇和氯化銨誘導建立高草酸尿癥大鼠模型，隨后測定尿液草酸濃度后發(fā)現(xiàn)OPN表達量隨著尿液草酸濃度增加而增加，實驗后期隨著草酸濃度的降低而減弱。并且OPN表達起始于集合管，逐漸向髓袢蔓延，重吸收作用后尿液草酸濃度在集合管達到峰值，表明尿液草酸濃度可影響腎單位中OPN的表達，而且高表達于集合管與髓袢，提示腎集合管與髓袢可能是草酸鈣結石形成的起始部位。綜上所述，可以認為高濃度草酸能損傷腎小管上皮細胞，使草酸鈣表達增加，隨后加速草酸鈣晶體聚集、成核、增加晶體滯留，從而促進結石的形成。

4 骨橋蛋白與草酸鈣結石

4.1 腎組織中的骨橋蛋白與草酸鈣結石

一般認為，骨橋蛋白能抑制草酸鈣晶體的形成。Lieske等[21]研究發(fā)現(xiàn)，COM晶體能迅速結合腎上皮細胞，而且濃度越高，結合速度越快，推測其機制為OPN與草酸鈣晶體表面黏附相關位點結合，從而阻止晶體與腎小管上皮細胞結合。Wesson等[22]用乙二醇分別誘導OPN基因敲除的成年小鼠和正常小鼠，形成高草酸尿模型，到第4周后，OPN基因敲除小鼠的腎小管內(nèi)形成大量草酸鈣晶體，而正常小鼠則無晶體形成，提示OPN能抑制草酸鈣結晶形成。體外實驗表明[23]，OPNAs3（3-磷酸絲氨酸肽）和OPNAs5（5-磷酸絲氨酸肽）濃度越高，二水草酸鈣（COD）在溶液中的成核和生長越慢，并且增加OPN的磷酸化水平，對COD的抑制作用更強更穩(wěn)定。為了研究OPN在COM結石形成過程中的作用，Langdon等[24]通過向人造尿液中添加OPN誘導草酸鈣結晶形成，然后用掃描電子（SEM）和共聚焦顯微鏡研究OPN-COM相互作用，結果發(fā)現(xiàn)在低濃度的OPN中形成的COM晶體呈拉長的六邊形，隨著OPN濃度的增加，COM晶體形態(tài)逐漸變化，最終變成啞鈴形晶體。進一步測量單個晶體的體積時發(fā)現(xiàn)，隨著OPN濃度的增加，COM晶體體積不斷減小，從而可以推斷OPN通過抑制草酸鈣結晶而抑制草酸鈣結石的形成。關于OPN在草酸鈣結石形成過程中的作用，部分學者卻有不同的見解。Mo等[25]發(fā)現(xiàn)約10%的OPN基因敲除小鼠和14.3%THP（Tamm-Horsfall蛋白）基因敲除小鼠在腎乳頭處自發(fā)形成磷酸鈣沉淀，而正常小鼠則未出現(xiàn)任何沉淀，并且這2類小鼠的尿液均具有促進一水草酸鈣晶體與腎上皮細胞黏附的能力。歐善際[26]用原位反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應技術測定大鼠體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞OPN mRNA 的表達發(fā)現(xiàn)，在受COM刺激后，大鼠腎小管上皮細胞OPN表達增強，但高濃度的COM 卻降低OPN表達。Hirose等[27]進一步研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)乙醛酸鹽給藥后，腎皮質(zhì)-髓質(zhì)連接處OPN蛋白表達逐漸增加，OPN mRNA表達從12小時開始增加，在24小時逐漸下降。在超顯微結構觀察中，6小時后OPN開始出現(xiàn)在腎遠端小管的細胞晶核和塌陷的線粒體中，并在12小時后在腎小管管腔中逐漸檢測到。在OPN基因敲除小鼠腎細胞中，24小時可見到塌陷的線粒體，但未見有晶核形成。表明腎小管細胞損傷后，OPN在損傷的細胞器中聚集，從而成為晶核形成的開始。同樣的，吳敬彰等[28]研究OPN在結石患者腎組織中的表達時發(fā)現(xiàn)，結石組患者腎組織中的OPN表達量顯著高于對照組。趙明等人[29]在研究骨橋蛋白對大鼠發(fā)生草酸鈣腎臟結石的影響時發(fā)現(xiàn)，OPN siRNA組OPN蛋白表達水平顯著低于空載組，顯著高于對照組，而OPN siRNA組大鼠腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)草酸鈣結石均顯著低于空載組，顯著高于對照組，從而可以認為OPN具有促進草酸鈣腎結石形成的作用。鄧茂放等[30]在研究烏梅提取物對腎結石模型大鼠腎功能的保護作用及機制時發(fā)現(xiàn)，模型組和實驗組腎組織中OPN蛋白免疫組化評分明顯高于正常組，模型組大鼠較正常組大鼠腎小管上皮細胞中OPN蛋白表達量增多，由此可以推斷OPN促進結石形成。以上研究都表明OPN在促進腎小管中滯留的晶體轉(zhuǎn)化為腎結石過程中起關鍵作用，甚至導致臨床尿石癥。

4.2 尿液中的骨橋蛋白與腎結石

一般情況下，尿液中鈣離子、草酸根離子處于過飽和狀態(tài)，但大多數(shù)人不形成結石，表明尿液中存在某些抑制結石形成的物質(zhì)，可通過影響晶體結晶而抑制草酸鈣結石形成。目前發(fā)現(xiàn)，存在尿液中的大分子結石抑制物包括：THP、OPN、枸櫞酸鹽、間α胰蛋白酶抑制物、S100A8蛋白、乙二胺四乙酸等[31]。其中，尿液中的OPN在抑制結石晶體形成過程起到關鍵作用。腎集合管及髓袢等部位合成并分泌OPN到尿液中，起到抑制結石形成的作用。OPN 的分泌無性別差異，與鈣、肌酐排泄無直接關系，而與尿量的變化呈負相關[32]。Asplin 等[33]研究OPN對草酸鈣晶體形成的作用時發(fā)現(xiàn)，抑制半數(shù)COM晶體生長、聚集的OPN濃度分別為（16±2）nmol/L、（28±4）nmol/L，而正常人尿液OPN 的濃度卻高達（131±13）nmol/L，完全能夠抑制尿草酸鈣晶體的生長、聚集。Yasui等[34]測定結石患者尿液OPN濃度后發(fā)現(xiàn)，其濃度和排泄率均降低，并推測結石患者尿液中OPN含量降低可能有2種原因：①OPN合成量不足，使尿液中OPN濃度不足以抑制草酸鈣結石的形成;②OPN的合成量正常，由于OPN摻入生長的結石中，經(jīng)尿液排出的OPN減少，也不足以抑制結石的形成。Thurgood等[35]在研究晶體內(nèi)和表面結合的OPN對COD晶體的影響時發(fā)現(xiàn)，在濃度分別為0 mg/L、1 mg/L和5 mg/L的OPN中，尿液中形成COD晶體的大小分別為21.9 μm、19.3 μm和16.5 μm，表明OPN抑制COD晶體生長，并且抑制作用呈劑量依賴性。王炎等人[36]在研究加味健脾益腎方對腎結石術后尿骨橋蛋白的影響時發(fā)現(xiàn)，治療組治療2周、4周時，尿OPN含量比治療前明顯升高，說明加味健脾益腎方可以通過提高尿中OPN水平進而抑制草酸鈣結石形成。也有學者持相反的觀點，Konya等[37]研究草酸鈣晶體聚集和生長的抑制活性過程中發(fā)現(xiàn)，固定在膠原顆粒表面的OPN能增加草酸鈣晶體的黏附和聚集，并且可以增加新形成的晶體的黏附力，高濃度的草酸鈣也能將OPN包裹，成為結晶形成的始發(fā)部位，從而促進草酸鈣結石的形成。

5 小結和展望

泌尿系結石是一種由多因素參與、形成過程非常復雜的疾病，發(fā)病機制目前還有待研究。OPN作為多功能的磷酸化糖蛋白，在結石晶體聚集、成核、生長環(huán)節(jié)中扮演著重要的角色。盡管已經(jīng)對OPN與泌尿系結石的形成關系做了大量研究，但目前仍不能明確其在草酸鈣結石形成中的具體作用。對OPN的結構、功能、調(diào)節(jié)、與草酸的關系等方面的研究，有助于為草酸鈣形成機制的研究提供理論指導與依據(jù)，對于泌尿系結石的預防、降低結石病在人群中的發(fā)病率有一定的指導意義。

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（收稿日期：2019-01-06 修回日期：2019-01-21）

（編輯：梁明佩）