大白豬DQB第2外顯子SNP多態(tài)性分析

韋思婷，程一飛，舒星富

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

動(dòng)物識(shí)別自己、排除非己以維持機(jī)體正常生理活動(dòng)和抗疾病的能力是免疫系統(tǒng)的核心職能。這種能力很大程度上是由主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex， MHC）基因所決定的。SLA基因系統(tǒng)是個(gè)高度多態(tài)的系統(tǒng)，它的高度多態(tài)性使它成為很好的遺傳標(biāo)記，且有可能作為分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇。SLA被定位于豬7號(hào)染色體著絲粒的兩端，其基本結(jié)構(gòu)與功能上存在差別，一般有三個(gè)主要類群，分別為：Ⅰ類基因、Ⅱ類基因和Ⅲ類基因。SLAⅡ類基因主要有 DRA、DRB、DQA、DQB、DOB、Dpa、TAP、LMP等，遺傳多態(tài)性最為豐富的區(qū)域是DR和DQ亞區(qū)，在控制機(jī)體的免疫應(yīng)答與調(diào)節(jié)中DR亞區(qū)和DQ亞區(qū)起著重要作用，與豬的抗病能力息息相關(guān)[1]。楊文平等[2]采用 PC R-R FLP 法對(duì)山西白豬 SLA-DQB基因外顯子 2 多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明山西白豬 SLA-DQB 外顯子 2 在 HaeⅢ酶切位點(diǎn)上有多態(tài)性。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)的試驗(yàn)動(dòng)物為大白豬。取仔豬耳組織 5～6 g，放入盛有 75%乙醇的EP管中，將EP管置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，在-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?。本試?yàn)采用的是傳統(tǒng)的苯酚-氯仿抽提法以及DNA提取試劑盒對(duì)基因組DNA進(jìn)行提取，TE溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照根據(jù) Shia 等[3]報(bào)道的合成 SLA-DQB 基因外顯子 2 引物序列，由大連寶生物工程有限公司合成引物，擴(kuò)增基因的目的片段大小約為273bp。序列為：上游引物（Primer F）：5’-CGGAATTCCCCGCAGAG GATTTCGTGTACC-3下游引物（Primer R）：5’-CCGTCGTGCCTTCCTCTAT-3’。

1.2.2 DNA混合池的構(gòu)建 在所有樣品中隨機(jī)挑選大白豬的20個(gè)DNA樣，然后進(jìn)行混合。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增和產(chǎn)物測(cè)序 PCR擴(kuò)增體系總共為20μL ：去離子水7.4μL，上、下游引物各 0.4μL，DNA 模板 0.8μL，2 × Power Taq PCRMasterMix 11μL。

PCR擴(kuò)增的最佳條件為：94 ℃預(yù)變性90 s;94 ℃變性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共30 個(gè)循環(huán);72 ℃最后延伸 5 min; 4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。在蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物混合測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白豬DQB基因第2外顯子PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)大白豬DQB基因第2外顯子的擴(kuò)增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，電泳檢測(cè)得到的條帶與目的片段大小一致約為273 bp，可用于直接測(cè)序。

圖 1 大白豬SLA-DQB 基因外顯子2 的PCR 產(chǎn)物檢測(cè)

2.2 大白豬DQB基因第2外顯子序列測(cè)定

大白豬DQB基因第2外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果如圖2所示，在DQB基因第2外顯子上一共有18個(gè) SNP 位點(diǎn)。

圖2 大白豬 DQB基因外顯子2序列

3 討論

生物種群在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中某些個(gè)體會(huì)發(fā)生基因突變，產(chǎn)生復(fù)等位基因，導(dǎo)致生物體內(nèi)合成不同類型的蛋白質(zhì)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphisms，SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，形式包括單堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換及顛換等。吳圣龍等[4]對(duì)3個(gè)江西省地方豬種 SLA-DQB 基因外顯子 2 的多態(tài)性進(jìn)行研究，研究表明3個(gè)豬種SLA- DQB基因外顯子2多態(tài)性非常豐富。董高華等[5]采用DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)15頭野豬的SLA-DQB基因外顯子2序列進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明野豬SLA-DQB外顯子2具有較豐富的核苷酸多態(tài)性。晁哲等[6]對(duì)五指山DQB基因進(jìn)行研究，結(jié)果在DQB基因組中發(fā)現(xiàn)4處基因突變位點(diǎn)。本研究采用擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序法來(lái)對(duì)大白豬DQB 基因第2外顯子的SNP多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大白豬一共有18個(gè)SNP位點(diǎn)，表明大白豬DQB基因具有高度多態(tài)性。