家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用

吳　駿　羅　漫　郝志華　謝玉凱　黃曉冰　馬維苑　田　鈴

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家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用

吳駿羅漫郝志華謝玉凱黃曉冰馬維苑田鈴

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 廣東廣州 510642）

自家蠶基因組測(cè)序完成以來，家蠶的相關(guān)研究進(jìn)入了后基因組時(shí)代，也使得家蠶的轉(zhuǎn)基因技術(shù)得以迅速的發(fā)展。文章介紹了家蠶中轉(zhuǎn)基因的技術(shù)及其發(fā)展現(xiàn)狀，為今后的基因編輯技術(shù)、轉(zhuǎn)基因家蠶研究以及生物反應(yīng)器等應(yīng)用提供了借鑒與參考。

家蠶；轉(zhuǎn)基因；基因編輯；生物反應(yīng)器

自20 世紀(jì)80年代開始，在世界范圍內(nèi)掀起了動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究熱潮。1984年，我國(guó)開始了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究，并取得了一系列成果，如：含人—珠蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建[1]、含乙型肝炎表面抗原基因的轉(zhuǎn)基因兔的獲得，以及我國(guó)首例轉(zhuǎn)基因克隆牛的誕生[2]，這些都標(biāo)志著我國(guó)在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域有了一定的研究進(jìn)展。

家蠶（）為鱗翅目絹絲昆蟲，是我國(guó)重要的特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，主要以桑葉為食，分泌的蠶絲是一種天然的紡織原料。蠶絲產(chǎn)業(yè)曾在我國(guó)出口創(chuàng)匯和脫貧致富中發(fā)揮著重要的作用，但是隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及社會(huì)需求的轉(zhuǎn)變，傳統(tǒng)蠶桑產(chǎn)業(yè)已經(jīng)發(fā)展到瓶頸期，如何進(jìn)行傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)改革、利用家蠶進(jìn)行多元化開發(fā)已成為當(dāng)今家蠶研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

2004年我國(guó)科學(xué)家率先完成了家蠶基因組的測(cè)序工作，使得我國(guó)家蠶遺傳或是分子生物學(xué)的研究開始走在世界的前列。同時(shí)，隨著基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)的不斷深入與發(fā)展，尤其是基因組精準(zhǔn)編輯技術(shù)和轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)的不斷推進(jìn)，使其在家蠶科學(xué)研究中的應(yīng)用也越來越廣泛。以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為工具，對(duì)家蠶的功能基因進(jìn)行遺傳操作，進(jìn)而嘗試表達(dá)目的蛋白或者改變家蠶經(jīng)濟(jì)性狀已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)。本文綜述了近年來適用于家蠶轉(zhuǎn)基因的技術(shù)和轉(zhuǎn)基因應(yīng)用成果，以期為今后的相關(guān)研究提供參考。

1 家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)

1.1 家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作的方法

轉(zhuǎn)基因技術(shù)指的是將外源DNA片段利用基因工程技術(shù)導(dǎo)入特定的受體中，使之與受體的基因進(jìn)行重組，并穩(wěn)定表達(dá)的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在家蠶中常用的操作方法有：顯微注射法、精子介導(dǎo)法、基因槍法等。

1.1.1 顯微注射法

顯微注射技術(shù)是一種通過顯微注射操作儀將外源物質(zhì)、細(xì)胞核或細(xì)胞注入到受體中的微操作技術(shù)，應(yīng)用廣泛且效果良好。Tamura[3]等于1990年建立家蠶顯微注射操作技術(shù)，并成功獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因家蠶品系。目前，利用顯微注射法進(jìn)行家蠶轉(zhuǎn)基因操作已經(jīng)非常成熟，并有了很多創(chuàng)新，如Sun[4]等構(gòu)建了兩個(gè)轉(zhuǎn)基因RNAi載體，并利用顯微注射法獲得了具有濃核病抗性的轉(zhuǎn)基因家蠶品系。但是，該方法對(duì)儀器和操作人員的技術(shù)有一定的要求，且可能會(huì)導(dǎo)致卵體受傷、孵化率低等問題。

1.1.2 精子介導(dǎo)法

精子介導(dǎo)法是一種利用精子能瞬間吸收外源基因的特性，將整合了外源目的基因的載體與精子進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，使部分精子帶上外源基因，在受精時(shí)與卵細(xì)胞結(jié)合，達(dá)到基因重組目的的一種方法。具體可分為先注后交法、先交后注法、人工受精法。郭秀洋[5]等、Zhou[6]等都利用該方法成功得到轉(zhuǎn)基因家蠶，驗(yàn)證了該方法的可行性。

1.1.3 基因槍導(dǎo)入法

基因槍導(dǎo)入法又被稱為粒子轟擊技術(shù)，孟智啟[7]等于1992年首次使用該方法，成功將金屬粒子以550 ～ 600 m/s的轟擊速度沖破卵殼打入卵內(nèi)，經(jīng)過檢測(cè)大多數(shù)卵發(fā)育正常，利用該方法一些科學(xué)家獲得了表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因家蠶品系。

1.1.4 其他方法

除上述幾種常用的方法外，轉(zhuǎn)基因家蠶的操作方法還包括壓力滲透導(dǎo)入法 (osmoticmethod, OM)[8]、脈沖場(chǎng)電泳法(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)、電穿孔導(dǎo)入法(electroporation)及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等，都有一定的可行性。

1.2 家蠶轉(zhuǎn)基因載體

轉(zhuǎn)基因載體是一類裝載有外源 DNA并且能使其隨自身復(fù)制而得到擴(kuò)增的DNA構(gòu)造，它可以將外源DNA在一定條件下插入到宿主基因中。轉(zhuǎn)基因載體包括一些固有的元件，如啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)座子序列等。在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)時(shí)，除了注意目的基因的導(dǎo)入方法和導(dǎo)入時(shí)期外，選擇合適的啟動(dòng)子和構(gòu)建合適類型的載體也是影響實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。

1.2.1 家蠶轉(zhuǎn)基因所用載體的啟動(dòng)子

啟動(dòng)子是一段能識(shí)別、結(jié)合RNA聚合酶并使自身活化、啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。在轉(zhuǎn)家蠶基因的研究中，適合的啟動(dòng)子是決定外源基因能否成功表達(dá)的重要因素之一。目前常見的家蠶轉(zhuǎn)基因所用載體的啟動(dòng)子有肌動(dòng)蛋白A3啟動(dòng)子[9]、人工啟動(dòng)子3Xp3[10]、熱激蛋白啟動(dòng)子[11]、抗菌肽啟動(dòng)子、家蠶絲心蛋白啟動(dòng)子[12]和家蠶核型多角體病毒早期即刻蛋白基因啟動(dòng)子[13]等。

1.2.2 家蠶轉(zhuǎn)基因所用載體類型

1.2.2.1 基于轉(zhuǎn)座子的載體

piggyBac轉(zhuǎn)座子是一種DNA轉(zhuǎn)座子，由于存在可攜帶較長(zhǎng)的基因片段、整合效率較高等優(yōu)點(diǎn)，它在家蠶的轉(zhuǎn)基因技術(shù)中得到了廣泛應(yīng)用。在2000年，Tamura[14]等首次將piggyBac轉(zhuǎn)座子應(yīng)用于家蠶中，其將家蠶細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白（BmA3）啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）基因連在含piggyBac的末端重復(fù)序列的質(zhì)粒上，與含有piggyBac轉(zhuǎn)座酶基因的輔助質(zhì)粒共同注射于胚胎前期蠶卵中，雖然成功獲得轉(zhuǎn)基因品系，但是表達(dá)效果并不理想。針對(duì)BmA3啟動(dòng)子效率較低的問題，Horn和Wimmer將piggyBac載體進(jìn)行改進(jìn)，之后Thomas[15]用改進(jìn)的piggyBac載體注射蠶卵，并取得較好的表達(dá)效果。

minos轉(zhuǎn)座子是一種可在家蠶胚胎和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)移DNA的轉(zhuǎn)座元件[16]，Shimizu[17]、Uchino[18]等先后將其應(yīng)用于家蠶轉(zhuǎn)基因研究中。Mosl元件也可應(yīng)用于家蠶轉(zhuǎn)基因研究中，Wang[19]等利用其成功將外源基因?qū)塍w外培養(yǎng)的家蠶細(xì)胞（Bm5）中，由于minos轉(zhuǎn)座子和Mosl元件都具有插入位點(diǎn)不確定性的缺點(diǎn)，因此后來都被piggyBac轉(zhuǎn)座子所取代[20]。

1.2.2.2 基于病毒的載體

研究發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒也可以充當(dāng)載體，將目的基因高效地整合到家蠶基因組中，是一種良好的家蠶轉(zhuǎn)基因工具。桿狀病毒主要以家蠶核型多角體病毒 （BmNPV）和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）為主，其原理主要是將目的基因插入到病毒的特定位點(diǎn)，利用病毒的特性，使外源基因整合到家蠶基因組中。相關(guān)的研究有，張峰[21]等利用家蠶細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白基因（A3）啟動(dòng)子和NPV病毒即刻早期蛋白IE啟動(dòng)子成功在家蠶細(xì)胞中表達(dá)了GFP基因。

逆轉(zhuǎn)錄病毒的應(yīng)用起步于20世紀(jì)90年代末，Nikolaev[22]等、Chan等先后利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR序列分別介導(dǎo)外源基因整合到家蠶、牛的基因組中；后來，河本夏雄等利用反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR序列將GFP基因?qū)爰倚Q體細(xì)胞，并對(duì)G0代幼蟲進(jìn)行了RCR檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了病毒載體成功侵入胚胎細(xì)胞中，逆轉(zhuǎn)錄出了cDNA。

1.2.2.3 基因打靶載體

隨著相關(guān)技術(shù)的提升，基因打靶技術(shù)在轉(zhuǎn)基因家蠶研究中得到一定的應(yīng)用，即利用同源重組原理，將外源基因定向地融合進(jìn)靶細(xì)胞基因組中的某個(gè)位點(diǎn)。自20世紀(jì)80年代興起后，逐漸被科學(xué)家用來對(duì)某一確定位點(diǎn)的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，以達(dá)到修飾基因的目的。相較于較常用的piggyBac轉(zhuǎn)座子載體，它可以有效的克服轉(zhuǎn)座子隨機(jī)整合的問題。1999年，Yamao[23 ]等將GFP基因與絲素輕鏈第7外顯子融合，利用AcMNPV載體，將GFP基因打靶進(jìn)蠶卵母細(xì)胞基因組絲素輕鏈中，并得以表達(dá)。2002年，朱成鋼[24]等將基因與家蠶絲心蛋白輕鏈基因融合，構(gòu)成一種新型的轉(zhuǎn)基因家蠶打靶載體pBacF53 TG。

1.2.2.4 其他基因載體

據(jù)相關(guān)報(bào)道，YAC載體也可應(yīng)用于家蠶轉(zhuǎn)基因中。李振剛[25]等利用YAC載體將天蠶絲基因整合于家蠶基因組中，獲得綠繭家蠶品系。

2 基因編輯技術(shù)在家蠶轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用

基因編輯技術(shù)是指通過人工核酸酶對(duì)動(dòng)物特定的內(nèi)源性基因進(jìn)行目地性的修飾, 如敲除、敲入、定點(diǎn)突變等, 并結(jié)合體細(xì)胞核移植與胚胎移植等技術(shù)手段, 以此獲得被修飾編碼的個(gè)體。基因編輯技術(shù)最早適用于基因的定點(diǎn)突變和敲除，其目的主要是在未引入外源基因的情況下對(duì)生物體進(jìn)行基因組上的精準(zhǔn)操作。但是隨著技術(shù)的發(fā)展，通過基因編輯工具，也可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便的基因敲入，所以也可以把基因敲入編輯的生物認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因生物。

目前，基因編輯技術(shù)主要發(fā)展了3代：分別是鋅脂核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonucleases, ZFNs)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶(transcription activatorlike effector endonucleases, TALENs) 和CRISPR/Cas9 [clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/Cas9(CRISPR associated 9) ]技術(shù)[26]。其中 TALEN技術(shù)和CRISPR/Cas9 技術(shù)目前應(yīng)用最為廣泛，兩者各有優(yōu)點(diǎn)，TALEN技術(shù)具有高度的特異性，而CRISPR/Cas9 技術(shù)的操作更簡(jiǎn)便。

表1　 基于人工核酸內(nèi)切酶的基因組靶向編輯技術(shù)在家蠶轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用

截止2018年部分?jǐn)?shù)據(jù)

3 家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

在眾多科學(xué)家的不懈努力情況下，家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)開始應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，主要在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域、家蠶遺傳育種和生物反應(yīng)器方面的應(yīng)用。

3.1 在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的應(yīng)用（功能基因組領(lǐng)域）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以應(yīng)用于家蠶功能基因的研究，探究家蠶基因的作用和家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。例如，Uhliová[31]等人利用piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功地研究了核受體基因的功能。結(jié)果顯示，的表達(dá)在家蠶每次蛻皮過程中受蛻皮激素的控制。在研究家蠶幼蟲體壁半透明基因基因的過程中，F(xiàn)ujii[32]等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)，該基因突變后的家蠶與油蠶幼蟲表皮中尿酸轉(zhuǎn)化成尿酸顆粒的過程受到抑制。除此之外，Tan[33]、Hongjiu[34]等也通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合GAL4/ USA雙元轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)進(jìn)行了一系列研究。

在不同品種的轉(zhuǎn)基因家蠶中，外源基因的表達(dá)效果可能存在差異，所以將家蠶基因的啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列與基因形成融合基因，再以此獲得轉(zhuǎn)基因家蠶，則可通過基因的表達(dá)情況，來顯示目的基因的表達(dá)調(diào)控，確定有利于目的基因表達(dá)的家蠶品系。Kurihara[35]等人就通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)絲膠缺乏家蠶在轉(zhuǎn)基因方面的應(yīng)用潛力。

3.2 在家蠶遺傳育種領(lǐng)域的應(yīng)用

隨著現(xiàn)代社會(huì)的高速發(fā)展，傳統(tǒng)品系的家蠶已經(jīng)難以滿足多元化的市場(chǎng)需要。相對(duì)于傳統(tǒng)的家蠶育種方式，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行家蠶育種，將特定的功能基因?qū)爰倚Q中，使之表達(dá)特定的性狀，這樣的品種往往能表現(xiàn)出傳統(tǒng)家蠶品系沒有的特征。目前已經(jīng)有很多科學(xué)家從事這方面工作，并取得了一些進(jìn)展。

3.2.1 抗性品種培育

自古以來，蠶病一直就是困擾蠶桑產(chǎn)業(yè)的一大難題。目前，主要的蠶病有病毒病、細(xì)菌病、真菌病等。其中，BmNPV病毒病具有易傳染、致病性強(qiáng)的特點(diǎn)，是蠶桑產(chǎn)業(yè)中最容易造成經(jīng)濟(jì)損失的病原之一，也是蠶?？茖W(xué)研究的主要對(duì)象。在2004年，Isobe[36]等人首次利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將RNA干擾BmNPV的片段在家蠶中過表達(dá)，使家蠶對(duì)BmNPV有了一定的抵抗力，這為培育家蠶抗病品種提供了新的思路。隨后，Kanginakudru[37]等人通過干擾BmNPV的基因，發(fā)現(xiàn)得到的轉(zhuǎn)基因家蠶抗BmNPV感染力有了明顯的提升。在此基礎(chǔ)上，蔣亮[38]等科學(xué)家也對(duì)此做了一系列后續(xù)研究，取得了突破性的進(jìn)展。

3.2.2 蠶絲品質(zhì)改良

蠶絲主要以絲素和絲膠為主，還含有蠟、碳水化合物、色素、灰份和天然雜質(zhì)等，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白纖維[39]，但蠶絲也存在不抗皺、不耐磨、產(chǎn)量不足等缺點(diǎn)。2011年，馬俐[40]等利用GAL4/UAS雙元轉(zhuǎn)換系統(tǒng)將促癌基因在家蠶體內(nèi)過量表達(dá)，大大提高了蠶絲產(chǎn)量，證實(shí)了轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用的可能性。除此之外，蠶絲的多元化應(yīng)用也成為了研究重點(diǎn)，如李珍[41]等成功研究出了具有抗菌功能的蠶絲。

3.3 在生物反應(yīng)器領(lǐng)域的應(yīng)用

目前家蠶生物反應(yīng)器主要是利用 piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將外源基因在家蠶后部絲腺中表達(dá)外源蛋白，形成家蠶絲腺生物反應(yīng)器（包括絲膠表達(dá)系統(tǒng)和絲素表達(dá)系統(tǒng)），同時(shí)也有研究人員開始進(jìn)行家蠶脂肪體生物反應(yīng)器和家蠶血淋巴生物反應(yīng)器的研究，嘗試以不同特點(diǎn)的家蠶組織表達(dá)不同類型的蛋白。

3.3.1 絲腺生物反應(yīng)器

家蠶絲腺分為前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺三個(gè)部分，前部絲腺具有導(dǎo)管作用；中部絲腺合成絲膠蛋白，其中主要由、、三個(gè)基因編碼；后部絲腺合成絲素蛋白，由 391 kDa的絲素重鏈（Fib-H）、26 KDa的絲素輕鏈(Fib-L)和 30 KDa的 P25 蛋白以6∶6∶1的摩爾比組成并作為蠶絲的基本結(jié)構(gòu)單位[42]。家蠶絲腺具有高效的合成和分泌蛋白的能力，所以大多數(shù)科學(xué)家都用絲腺來表達(dá)外源基因，并取得了不錯(cuò)的進(jìn)展。

在2002年，Tomita[43 ]等首次利用 piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因成功利用家蠶絲腺合成了人 III型前膠原蛋白，經(jīng)檢驗(yàn)在蠶繭中發(fā)現(xiàn)了該種蛋白。這有力地證明了絲腺作為生物反應(yīng)器的可能性。Ogawa[44]等在2007年利用piggyBac載體在轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭的絲膠層中成功表達(dá)并分離了重組人血清白蛋白（recombinant human serum albumin, rHSA），并通過研究發(fā)現(xiàn)其構(gòu)象和功能與天然產(chǎn)物相同。后續(xù)還有研究表明家蠶的絲腺可以產(chǎn)生小鼠蛋白的單抗[45]、人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[46]、狂犬病毒核蛋白[47]等。

此外，2018年Xu[48]等人還利用 TALEN技術(shù)，將家蠶絲素蛋白 H鏈敲除并敲入了蜘蛛絲蛋白基因，成功利用家蠶絲腺高表達(dá)了蜘蛛絲蛋白，其方法和意義值得關(guān)注和研究，家蠶絲腺作為生物反應(yīng)器的應(yīng)用前景巨大，值得進(jìn)一步研究。

3.3.2 脂肪體生物反應(yīng)器

脂肪體是昆蟲體內(nèi)的中間代謝器官，它起到了合成和代謝蛋白質(zhì)、脂類和糖類、降解有毒物質(zhì)等重要生理作用[49]。其分泌的蛋白有儲(chǔ)存蛋白、脂蛋白等多種功能蛋白[50]。

部分學(xué)者針對(duì)這些功能，進(jìn)行了相關(guān)研究。幸俊逸[51 ]等于2010年通過顯微注射技術(shù)，將含有主要抗原位點(diǎn)的O型口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白基因?yàn)闃?biāo)靶的piggyBac表達(dá)載體成功導(dǎo)入家蠶胚胎，獲得轉(zhuǎn)基因蠶。經(jīng)驗(yàn)證，重組口蹄疫 VPI蛋白成功在家蠶脂肪體中表達(dá)。劉耀文[52]等也成功通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶脂肪體表達(dá)了重組植酸酶。此外，胡瑩瑩[53]等利用非轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)培育轉(zhuǎn)基因家蠶，在脂肪體中也得到了有效表達(dá)。

3.3.3 血淋巴生物反應(yīng)器

家蠶血淋巴是家蠶血液與家蠶淋巴液的混合體，是一個(gè)開放的系統(tǒng)，內(nèi)含物豐富，其中就含有大量的蛋白質(zhì)，它們?cè)诩倚Q的生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到了重要作用。

Susumu[54]等于1985年利用了桿狀病毒表達(dá)載體在家蠶中成功表達(dá)了人α-干擾素，活性達(dá)到了5×107U/50 μg。隨著研究的深入，重人乳蛋白[55]、P25 蛋白和 Fib-L蛋白[56]、Aβ42 和 CTB-Aβ15 蛋白[57]等都被科學(xué)家在家蠶血淋巴中成功地表達(dá)?？梢姡约倚Q血淋巴作為生物反應(yīng)器的可行性還是非常高的。

4 存在的問題

家蠶作為鱗翅目的模式昆蟲，具有生長(zhǎng)周期短、易飼養(yǎng)、繁殖率高、遺傳背景清楚等優(yōu)點(diǎn)。在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究時(shí)，家蠶可以使用人工飼料飼養(yǎng)，且成蟲無法飛行，即可以隔離飼養(yǎng)，這也為轉(zhuǎn)基因研究帶來了便利，當(dāng)然存在的問題也很明顯：

（1）轉(zhuǎn)座子隨機(jī)整合：轉(zhuǎn)座子隨機(jī)整合會(huì)導(dǎo)致目的基因的表達(dá)發(fā)生變化，即上調(diào)表達(dá)、下調(diào)表達(dá)和異位。這可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因家蠶出現(xiàn)基因?qū)哟蔚呢?fù)面變化，進(jìn)而影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)。目前已經(jīng)有部分科學(xué)家正在研究條件基因打靶技術(shù)解決轉(zhuǎn)座子隨機(jī)整合問題[58]。

（2）標(biāo)記基因保留帶來的隱患：上文中提到，在家蠶轉(zhuǎn)基因相關(guān)操作中，標(biāo)記一般會(huì)保留在轉(zhuǎn)基因個(gè)體的基因組中，但是這會(huì)增加轉(zhuǎn)基因逃逸的可能性，且存在影響目的基因表達(dá)的可能性。針對(duì)這一問題，位點(diǎn)特異性重組法是目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中應(yīng)用比較廣泛的解決方法之一。早在2012年，Long等[59]利用一種基于釀酒酵母（）的FLP/FRT系統(tǒng)的方法，成功定點(diǎn)敲出了標(biāo)記基因。

（3）外源基因?qū)牒蟮谋磉_(dá)效率：和很多轉(zhuǎn)基因生物一樣，轉(zhuǎn)基因家蠶也存在外源基因表達(dá)效率不高等問題。尤其是在家蠶生物反應(yīng)器方面，外源基因的整合率和表達(dá)水平較低一直困擾著研究人員。

5 結(jié)語和展望

隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新技術(shù)、新成果將應(yīng)用于家蠶轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域。伴隨研究的深入，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶育種及資源的品質(zhì)創(chuàng)新等方面展現(xiàn)了其他技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢(shì)和潛力，如果我們加以合理的應(yīng)用，必將為傳統(tǒng)蠶桑產(chǎn)業(yè)的升級(jí)發(fā)展和創(chuàng)新應(yīng)用帶來新的機(jī)遇。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2019.04.01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31472042，31672368)；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(2018年)。

田鈴，教授。

吳駿(1999- )，男，安徽池州人，本科生，研究方向：蠶學(xué)。

S882.6

A

2095-1205(2019)04-01-05