二步酶解法制備魚(yú)鱗明膠抗氧化肽及其抗氧化活性研究

盧素珍 - 涂宗財(cái),2,3 -,2,3 王 輝 祝 鄒

(1. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2. 江西師范大學(xué)國(guó)家淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌 330022；3. 江西省淡水魚(yú)高值化利用工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330022)

中國(guó)是淡水魚(yú)養(yǎng)殖大國(guó)，2013～2017年，淡水魚(yú)養(yǎng)殖年產(chǎn)量為2 481～2 815萬(wàn)t，淡水魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加，而淡水產(chǎn)品加工總量只有362～408萬(wàn)t，加工利用率僅為13.77%～16.06%[1-5]。另一方面，魚(yú)類加工的副產(chǎn)物主要包括魚(yú)頭、皮、鰭、鱗、卵和內(nèi)臟等，約占加工魚(yú)類生物量的60%以上，這些副產(chǎn)物少部分被加工成低廉的飼料，大部分被直接丟棄造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)，一定程度上影響了漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[6-7]。

活性氧自由基在生物體信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但當(dāng)機(jī)體內(nèi)的自由基過(guò)剩時(shí)則可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷，誘發(fā)糖尿病、冠心病和癌癥等諸多疾病[8]?？寡趸目梢蕴岣呖寡趸傅幕盍亩档突钚匝踝杂苫乃?，保護(hù)細(xì)胞抵御自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷[9]。酶解工藝是抗氧化肽制備的關(guān)鍵，主要的酶解方法包括單酶法[10-11]和多酶分步酶解法[12-13]。如Zhao等[14]和Zhang等[15]分別通過(guò)單酶法制備敏魚(yú)魚(yú)鰾和海蜇頭抗氧化肽，Yarnpakdee等[12]和Yang等[8]分別通過(guò)雙酶二步酶解法制備羅非魚(yú)和帶魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽。與單酶解法相比，雙酶二步酶解法具有酶切位點(diǎn)多、酶解程度高，更易制備高抗氧化活性肽的優(yōu)勢(shì)[8]。

因此，本研究擬以草魚(yú)魚(yú)鱗為原料，通過(guò)雙酶二步酶解法制備草魚(yú)魚(yú)鱗明膠抗氧化肽，為草魚(yú)魚(yú)鱗的提值增效和提高淡水魚(yú)產(chǎn)品加工利用率提供參考。并通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)二步酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，為草魚(yú)魚(yú)鱗明膠抗氧化肽的制備提供一種高效、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

草魚(yú)魚(yú)鱗：南昌市鄱陽(yáng)湖農(nóng)牧漁業(yè)發(fā)展股份有限公司；

堿性蛋白酶：8.68×107U/g，諾維信生物技術(shù)有限公司；

胰蛋白酶(4.07×107U/g)、風(fēng)味蛋白酶(1.83×105U/g)、木瓜蛋白酶(4.27×106U/g)、胃蛋白酶(4.92×106U/g)、抑肽酶：索萊寶生物科技有限公司；

乙腈、三氟乙酸、細(xì)胞色素C、L-還原型谷胱甘肽和羥脯氨酸：色譜純，索萊寶生物科技有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：D-2000 HSM型，日本Hitachi公司；

酶標(biāo)儀：synergH1型，美國(guó)伯騰儀器有限公司；

電子天平：ML104/02型，梅特勒—托利儀器(上海)有限公司；

pH計(jì)：DZG-6021P型，梅特勒—托利儀器(上海)有限公司；

冷凍干燥機(jī)：LGJ-1D-80型，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 魚(yú)鱗明膠抗氧化肽的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法制備草魚(yú)魚(yú)鱗明膠。第一步酶解的方法參考文獻(xiàn)[17]并修改如下：稱取10 g草魚(yú)魚(yú)鱗明膠于100 mL蒸餾水，按酶與底物的比例為1∶100(g/g)加入堿性蛋白酶，酶解條件為pH 8.0、溫度50 ℃、時(shí)間4 h，酶解結(jié)束后煮沸10 min，冷卻后，4 000 r/min離心10 min，上清液凍干。稱取10 g凍干的堿性蛋白酶水解物按表1進(jìn)行第二步酶解，酶解結(jié)束后煮沸滅酶10 min，離心取上清液。一部分上清液用于測(cè)定抗氧化活性、氨基態(tài)氮含量，另一部分凍干保存待用。所使用酶的活力按SB/T 10317—1999進(jìn)行測(cè)定。

表1 第二步酶解條件

1.2.2 水解度的測(cè)定 采用甲醛滴定法測(cè)定水解液中氨基氮的含量[18]，參照GB 5009.5—2006測(cè)定原料中總氮含量，按式(1)計(jì)算水解度。

(1)

式中：

h——水解度，%；

m1——氨基態(tài)氮含量，mg/mL；

m2——總氮含量，mg/mL。

1.2.3 分子量的測(cè)定 根據(jù)GB 31645—2018修改如下：XBridge BEH 125A SEC(7.8 mm×300 mm, 3.5 μm)；流動(dòng)相為乙腈—水—三氟乙酸(體積比40∶60∶0.05)，流速0.5 mL/min，上樣量10 μL，柱溫30 ℃，L-2400型紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。以細(xì)胞色素C(12 384 Da)、抑肽酶(6 512 Da)、L-還原型谷胱甘肽(613 Da)和羥脯氨酸(131 Da)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。平均分子量按式(2)計(jì)算：

logMw=-0.228 39t+6.539 04，

(2)

式中：

Mw——分子量，Da；

t——保留時(shí)間，min。

1.2.4 抗氧化能力的測(cè)定

(1) DPPH·清除能力：根據(jù)文獻(xiàn)[19]修改如下，600 μL 1 mg/mL的樣品與等體積0.039 mg/mL DPPH甲醇溶液混合均勻，避光反應(yīng)20 min，517 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)1。600 μL DPPH與等體積蒸餾水反應(yīng)為控制組A0，600 μL樣品與等體積甲醇反應(yīng)為對(duì)照組A2。相同濃度的二叔丁基羥基甲酚(BHT)作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH·清除率按式(3)計(jì)算。

(3)

式中：

S——自由基清除率，%；

A1——樣品組吸光值；

A2——對(duì)照組吸光值；

A0——控制組吸光值。

(2) ·OH清除能力:根據(jù)文獻(xiàn)[20]修改如下，500 μL 1 mg/mL的樣品與150 μL 2.22 mg/mL FeSO4、125 μL 0.68 mg/mL H2O2、500 μL 0.41 mg/mL水楊酸(乙醇溶解)，37 ℃水浴反應(yīng)20 min，離心1 min。上清液于510 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)1。500 μL蒸餾水代替樣品的吸光值為A0，125 μL甲醇代替H2O2的吸光值為A2。相同濃度的BHT作為陽(yáng)性對(duì)照?！H清除率根據(jù)式(3)計(jì)算。

(4) Fe2+螯合能力：根據(jù)文獻(xiàn)[22]修改如下， 800 μL 1 mg/mL的樣品與10 μL 0.25 mg/mL FeCl2、20 μL 2.46 mg/mL 菲洛嗪混合反應(yīng)10 min，562 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)1。800 μL蒸餾水代替樣品為控制組A0，10 μL蒸餾水代替FeCl2為對(duì)照組A2。相同濃度的BHT為陽(yáng)性對(duì)照。Fe2+螯合率按式(4)計(jì)算。

(4)

式中:

C——亞鐵離子螯合率，%；

A1——樣品組吸光值；

A2——對(duì)照組吸光值；

A0——控制組吸光值。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，以Fe2+螯合率為指標(biāo)，進(jìn)行溫度、時(shí)間和pH的三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0和Design-Expert 8.0.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，選取LSD和Duncan用于顯著性分析(P<0.05)，用Origin 2018作圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3個(gè)平行樣品的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 二步酶解對(duì)水解度的影響

水解度通常用于檢測(cè)蛋白質(zhì)肽鍵斷裂釋放出短鏈多肽的程度，水解度越大肽鍵斷裂釋放出的短鏈多肽越多[23-24]。二步酶解對(duì)水解度的影響如圖1所示，在堿性蛋白酶水解的基礎(chǔ)上，加入胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白和胃蛋白酶二步酶解后水解度分別提高了15.52%，17.99%，13.62%，6.68%，堿性蛋白酶—風(fēng)味蛋白酶水解物的水解度最大為27.63%，表明二步酶解可以顯著提高酶解物的水解度。這一結(jié)果與Sun等[24]和Sinthusamran等[25]的結(jié)果一致。螺旋藻蛋白通過(guò)堿性蛋白酶酶解水解度為25.47%，而通過(guò)堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶二步酶解水解度為32.90%，水解度增大了7.43%[24]。凡納濱對(duì)蝦通過(guò)自源酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶)進(jìn)行自體分解，水解度為35.31%，通過(guò)0.5%和1.0%堿性蛋白酶進(jìn)行二步酶解后，水解度分別為42.28%和44.93%，水解度分別增大了6.97%和9.62%[25]。

2.2 二步酶解對(duì)分子量的影響

如圖2所示，堿性蛋白酶水解物以及4種酶的二步酶解物的體積排阻色譜圖中主要的峰均為4個(gè)，表明水解物由4組不同分子量范圍的組分組成。

如表2所示，與堿性蛋白酶水解物相比，胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶二步酶解物中分子量較大的組分I、II和III的相對(duì)含量減小，而分子量較小的組分IV的相對(duì)含量增大，表明胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶能夠?qū)A性蛋白酶水解物中大分子量的肽段進(jìn)一步水解成分子量更小的肽段?？赡苁且鹊鞍酌?、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶在二步酶解過(guò)程中引入了新的酶切位點(diǎn)，以胰蛋白酶為例，其酶切位點(diǎn)是賴氨酸和精氨酸，在二步酶解過(guò)程中胰蛋白酶可以將含有賴氨酸和精氨酸的大分子量多肽進(jìn)一步酶解成分子量更小的多肽。

2.3 二步酶解對(duì)抗氧化能力的影響

表2 水解物中各組分的分子量及其相對(duì)含量?

? A堿性蛋白酶，B 堿性蛋白酶+胰蛋白酶，C 堿性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶，D堿性蛋白酶+木瓜蛋白酶，E堿性蛋白酶+胃蛋白酶。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

為進(jìn)一步優(yōu)化二步酶解條件，達(dá)到降低能耗、縮短時(shí)間、提高酶解效率的目的，結(jié)合項(xiàng)目組前期研究，以堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率為考察指標(biāo)，對(duì)胰蛋白酶第二步酶解的pH、溫度和時(shí)間進(jìn)行了三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分別見(jiàn)表3、4。

由表5可知，因素A、C對(duì)堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率影響顯著(P<0.01)，因素B不顯著(P>0.05)，交互相AB、AC和BC影響不顯著(P>0.05)；由F值可知，3個(gè)因素對(duì)堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率的影響依次是：時(shí)間>pH>溫度。模型的P值為0.002 1，達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，失擬項(xiàng)F值為0.033，不顯著(P>0.05)，表明模型擬合良好。以pH、溫度、時(shí)間為變量，堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平

表4試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

Table4Experimentaldesignschemewithexperimentalresultsforresponsesurfaceanalysis

試驗(yàn)號(hào)ABCFe2+螯合率/%1-1-1045.762-10158.3630-1-146.904-10-140.805-11047.58610-135.19700060.7780-1156.53900054.981010144.01111-1036.841211034.601300055.001401163.901501-148.20

表5Fe2+螯合率為響應(yīng)值的回歸模型方差分析?

Table5Analysisofvariance(ANOVA)ofregressionequationwithFe2+chelatingabilityasresponse

來(lái)源平方和自由度均方F值P值模型1 197.049133.0020.040.002 1??A219.001219.0032.990.002 2??B 8.5218.521.280.308 7C 334.201334.2050.350.000 9??AB4.1314.130.620.466 0AC19.08119.082.880.150 7BC9.2619.261.400.290 7A2577.641577.6487.030.000 2??B238.19138.195.750.061 7C20.1210.120.0180.898 3殘差33.1956.64失擬項(xiàng)10.9233.640.330.811 2純誤差22.26211.13合計(jì)1 230.2314

螯合率為響應(yīng)值，進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：

Y1=-852.013+203.249A+3.904B+0.789C-0.102AB-0.109AC+7.608×10-3BC-12.508A2-0.032B2+4.505×10-4C2。

(5)

通過(guò)響應(yīng)模型優(yōu)化得到堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率最大值為65.20%，此時(shí)第二步酶解的條件為pH 7.75、溫度53.19 ℃、時(shí)間50 min。

考慮到實(shí)際操作的方便性，調(diào)整第二步酶解的條件為底物濃度100 mg/mL、pH 7.8、溫度53 ℃、時(shí)間50 min，預(yù)測(cè)值的Fe2+螯合率是65.08%，重復(fù)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后計(jì)算平均值，得到實(shí)際Fe2+螯合率為65.72%，與預(yù)測(cè)值相差0.64%。由此可知，模型比較可靠。未優(yōu)化的第二步酶解的條件：底物濃度50 mg/mL、pH 8.0、溫度50 ℃、時(shí)間4 h，堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率為63.26%。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率提高了2.46%，底物濃度增大了1倍，酶解時(shí)間縮短了190 min。

2.5 酶解物的抗氧化活性

3 結(jié)論