5種致瀉大腸埃希氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測技術(shù)

王芳妹 - 鐘文濤 - 王淑好 - 盧 琳 韓奉玲 -

(1. 湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410007；2. 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南長沙 410081；3. 湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410081)

致瀉大腸埃希氏菌是一類能引起人體腹瀉的食源性病源微生物。由于致瀉性大腸埃希氏菌相同的基因片段內(nèi)保守區(qū)很相似，檢測單一基因片段特異性并不高，難以確認(rèn)或排除致瀉性大腸埃希氏菌感染，很容易造成漏檢[1-3]。因而5種致瀉性大腸埃希氏菌的檢測方法的靈敏度和準(zhǔn)確性對預(yù)防和控制由其引起的腹瀉有著十分重要的作用。

在新標(biāo)準(zhǔn)(GB 4789.6—2016)發(fā)布之前采用的檢測方法主要是從分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)鑒定、血清試驗(yàn)和腸毒素試驗(yàn)進(jìn)行鑒定[4-6]，該傳統(tǒng)檢測方法簡單易行、費(fèi)用低，但周期長，所用的試劑和血清要求嚴(yán)格[7]；對于那些致病菌含量很低且生化特征與普通大腸埃希氏菌相似的病原體，很難挑出真正的目的菌，也可能因?yàn)殡s菌增長速度過快不易檢出目的菌。2016年發(fā)布的GB 4789.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》中明確要求，在常規(guī)微生物檢測的基礎(chǔ)上必須要根據(jù)分子生物學(xué)中的PCR技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，此方法很好地解決了傳統(tǒng)方法中檢測特異性不高，耗時(shí)較長、操作較繁瑣等問題，但該方法對人員專業(yè)技術(shù)要求較高，試驗(yàn)試劑溴化乙啶對檢驗(yàn)人員的身體健康危害十分嚴(yán)重，并且在開蓋操作時(shí)會(huì)增加氣溶膠污染的可能性，造成假陽性的產(chǎn)生，難以根除[8-10]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中的TaqMan法對目標(biāo)序列具有較高的特異性，結(jié)果重復(fù)性也比較好，引物和探針的設(shè)計(jì)相對比較簡單，因此該方法已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究中。PCR技術(shù)的應(yīng)用十分廣泛，已從擴(kuò)增單一基因片段的PCR，發(fā)展到同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)基因的多重?zé)晒舛縋CR[11-16]。

目前，研究致瀉性大腸埃希氏菌與志賀菌等的區(qū)分或檢測某幾類大腸埃希氏菌的類似方法很多，如朱惠芳等[17]利用微生物法鑒定1株與志賀氏菌生化相似、抗原相同的大腸埃希氏，所用微生物法耗時(shí)耗力，人為因素干擾比較大，未根據(jù)分子方法進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，也未覆蓋其他大腸埃希氏菌的檢測；Youmans等[18]利用普通PCR對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌進(jìn)行檢測，Octaviana等[19]和趙愛蘭等[20]使用多重PCR方法鑒定了5類致瀉性大腸埃希菌，所使用的均為普通PCR，其擴(kuò)增結(jié)果需配制擴(kuò)增體系繁多，并進(jìn)行凝膠電泳，較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力、操作較繁瑣、引物特異性不高；張紅宇等[21]利用Taqman多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)即可在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出3種病原微生物，有效地解決了單基因PCR體系1次只可檢測1個(gè)基因型的低效缺點(diǎn)，但未覆蓋其他大腸埃希氏菌的檢測。本研究擬在以往研究的基礎(chǔ)上全面覆蓋檢測這5種致瀉大腸埃希氏菌，并且采用TaqMan探針技術(shù)結(jié)合了商品化的多重普通PCR技術(shù)的方法共同驗(yàn)證本研究的可行性，并對4種試劑盒進(jìn)行特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度的驗(yàn)證，旨在為準(zhǔn)確高效的全面篩檢5種致瀉大腸埃希氏菌提供參考，提高檢驗(yàn)質(zhì)量水平。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

Chelex-100提取液：寶生物工程(大連)有限公司；

DNA marker和預(yù)混合Taq PCR Master Mix(2×)：寶生物工程(大連)有限公司；

腦心浸液培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂、腸道增菌肉湯等：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；

引物和探針：生工生物工程(上海)股份有限公司；

5種致瀉大腸埃希氏菌多重普通PCR檢測試劑盒：北京卓誠惠生生物公司；

豬肉和牛奶：市售；

冷凍離心機(jī)：Fresco 17型，美國賽默飛世爾科技公司；

漩渦混勻器：MX-S型，美國賽洛捷克公司；

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：7500Fast型，美國ABI公司；

凝膠成像系統(tǒng)：ChemiDoc XRS+型，美國伯樂公司；

試驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：美國菌株保存中心(ATCC)或中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)菌種庫(見表1)。

表1 試驗(yàn)所用菌株

1.2 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成

腸道致病性大腸埃希氏菌(EPEC)的毒力基因?yàn)閑scV/eae、bfpB，產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(STEC)和腸道出血性大腸埃希氏菌(EHEC)的毒力基因?yàn)閑scV/eae、stx1、stx2A，產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)的毒力基因?yàn)閘t、stIa、stIb，腸道侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)的毒力基因?yàn)閕nvE/ipaH，腸道聚集性大腸埃希氏菌(EAEC)的毒力基因?yàn)閍stA、aggR、pic(見表1)；首先在NCBI中查找出escV、bfpB、stx1、stx2A、lt、stIa、stIb、invE、astA、aggR和pic的多個(gè)genebank序列號的基因序列，通過Genbank軟件和BLAST軟件進(jìn)行序列同源性分析，確定各毒力基因的保守區(qū)域，采用Primer Premier 5.0和DNAstar軟件在各自保守區(qū)域中設(shè)計(jì)引物與探針(見表2)，將設(shè)計(jì)好的引物和探針委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行人工合成。

1.3 模板制備

1.3.1 菌種活化和計(jì)數(shù) 將5種致瀉大腸埃希氏菌和食品中常見致病菌的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)(見表1)，取1 mL培養(yǎng)24 h后的菌液提取核酸，另取1 mL 菌液逐級稀釋至10-9，選擇4個(gè)稀釋度(10-6、10-7、10-8和10-9)分別吸取1 mL 在PCA平板中36 ℃培養(yǎng)生長2 d后計(jì)數(shù)。

表2 5種致瀉大腸埃希氏毒力基因的引物和探針序列?

? F為上游引物，R為下游引物，T為探針，F(xiàn)AM、ROX、JOE和CY5為熒光基團(tuán)，BHQ1、BHQ2和BHQ3為淬滅基團(tuán)。

1.3.2 核酸提取 取1 mL已活化的菌液至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心3 min。棄上清，加入5%的Chelex-100提取液30 μL，震蕩混勻，煮沸10 min后立刻放入冰上，12 000 r/min離心3 min后取上清擴(kuò)增待用或放入-20 ℃冰箱備用。

1.4 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系建立

根據(jù)致瀉大腸埃希氏菌攜帶的毒力基因及其探針的熒光報(bào)告基團(tuán)，設(shè)計(jì)4組反應(yīng)體系對5種致瀉大腸桿菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增和分型，其中1號反應(yīng)體系檢測EPEC、STEC、EHEC，擴(kuò)增escV、bfpB、stx1和stx2A基因；2號反應(yīng)體系檢測EIEC，擴(kuò)增ipaH和invE基因，3號反應(yīng)體系檢測ETEC，檢測lt、stIa和stIb基因，4號反應(yīng)體系檢測astA、aggR和pic基因。

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系(25 μL)：Taq PCR Master Mix(2×) 12.5 μL、上下游引物(10-5mol)各1 μL、菌株DNA模板2 μL、ddH2O 8.5 μL；實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)。

1.5 特異性分析

取1 mL已活化的沙門氏菌、副溶血性弧菌、單增李斯特氏菌、阪崎腸桿菌菌液，按1.3.2中的方法進(jìn)行提取核酸。使用本研究建立的4組實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系對此4種常見的食源性致病菌的基因組DNA進(jìn)行檢測，Ct值報(bào)告為“Undet”或無明顯的“S”型擴(kuò)增曲線，判定為陰性。

1.6 靈敏度分析

將已計(jì)數(shù)的5種致瀉大腸埃希氏菌進(jìn)行10倍梯度稀釋，取1 mL稀釋液，按1.3.2中的方法進(jìn)行提取核酸，使用本研究建立的4組實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系對各梯度稀釋液的核酸進(jìn)行檢測，當(dāng)檢測體系的Ct值<35.0時(shí)，有熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的“S”擴(kuò)增曲線，判定為陽性；當(dāng)35.0≤Ct值≤40.0時(shí)，且有典型的“S”擴(kuò)增曲線時(shí)，則需重復(fù)試驗(yàn)。再次擴(kuò)增后檢測體系的Ct值仍≤35.0，判定為陽性。當(dāng)再次擴(kuò)增后，檢測體系Ct值>35.0，或無典型的擴(kuò)增曲線，則判定為陰性。

1.7 與商品化PCR試劑盒對比分析

將本研究中檢測為陽性的5種致瀉大腸埃希氏菌使用商品化PCR試劑盒進(jìn)行同步對比，分析2種方法的檢測結(jié)果一致性。

1.8 大量樣本驗(yàn)證

將本單位抽查和委托本單位檢驗(yàn)的40例肉類、奶產(chǎn)品、動(dòng)物腹瀉物和人工污染樣品，分別使用本研究建立的4組實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系和商品化PCR試劑盒進(jìn)行同步檢測，分析2種方法的檢測結(jié)果，統(tǒng)計(jì)陽性符合率和陰性符合率。

1.9 數(shù)據(jù)分析

測得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)以(X±S)來表示，以Excel進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測5種致瀉大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株的結(jié)果

設(shè)計(jì)大腸埃希氏的內(nèi)參基因uidA的引物探針，上游引物為ACTATGCCGGGATCCATCGC，下游引物為CAACAGACGCGTGGTTACAGT，探針為ROX-GTAATGCTCTACACCACGCCGAACACCT-BHQ2，按1.4 配制反應(yīng)體系，ABI 7500 Fast儀器中檢測，結(jié)果顯示(圖1)，6種致瀉大腸埃希氏的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株的內(nèi)參uidA基因均有明顯的“S”型擴(kuò)增曲線，并且Ct值基本一致，均位于15～35[22]，說明提取的5種致瀉大腸埃希氏核酸質(zhì)量良好，可保障后續(xù)試驗(yàn)的有效性。

圖1 大腸埃希氏菌內(nèi)參基因uidA的擴(kuò)增圖譜

2.2 檢測5種致瀉大腸埃希氏標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株毒力基因的結(jié)果

將人工合成的12對毒力基因的引物和探針組合至4種反應(yīng)體系中，對5種大腸埃希氏菌的核酸進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示(圖2)：EPEC與EHEC的4種毒力基因stx1、stx2A、bfpB和escV；EAEC的3種毒力基因astA、aggR和pic；EIEC的2種毒力基因invE和ipaH；ETEC的3種毒力基因lt、stIa和stIb均有明顯的“S”型擴(kuò)增曲線，且Ct值均位于15～35，說明4個(gè)反應(yīng)體系對5種致瀉大腸埃希氏菌核酸檢測效果非常好。

2.3 檢測4種試劑盒的特異性試驗(yàn)

使用本研究建立的檢測方法對常見食源性致病菌：沙門氏菌、副溶血性弧菌、單增李斯特氏菌和阪崎腸桿菌的核酸進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示(表3)，沙門氏菌、副溶血性弧菌、單增李斯特氏菌和阪崎腸桿菌中均檢測為陰性，說明使用本研究建立的5種致瀉大腸埃希氏菌的檢測方法特異性強(qiáng)。大腸桿菌O157：H7血清型是EHEC一種代表菌株，其攜帶EHEC的毒力基因escV，表3顯示escV基因的檢測結(jié)果為陽性，進(jìn)一步驗(yàn)證了本方法的有效性和特異性。

2.4 檢測4種試劑盒的靈敏度試驗(yàn)

對不同濃度的5種致瀉大腸桿菌進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3和表4，腸道致病大腸埃希氏菌(EPEC)的檢測范圍為106～102CFU/mL，檢測限102CFU/mL；產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(STEC)和腸道出血性大腸埃希氏菌(EHEC)的檢測范圍為106～102CFU/mL，檢測限102CFU/mL；產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(EIEC)的檢測范圍為106～102CFU/mL，檢測限102CFU/mL腸道致病大腸埃希氏菌(ETEC)的檢測范圍為106～102CFU/mL，檢測限102CFU/mL；腸道致病大腸埃希氏菌(EAEC)的檢測108～104CFU/mL，檢測限104CFU/mL，表明對5種致瀉大腸埃希氏菌檢測的靈敏度均較高。

將不同濃度的菌液進(jìn)行擴(kuò)增，4種試劑盒的擴(kuò)增曲線見圖3，當(dāng)菌液濃度<10 CFU/mL時(shí)，escV、bfpB、stx1、ipaH和invE基因均無擴(kuò)增曲線；當(dāng)菌液濃度<102CFU/mL 時(shí)，aggR基因無擴(kuò)增曲線；當(dāng)菌液濃度<103CFU/mL時(shí)，astA和pic也無擴(kuò)增曲線，表示此時(shí)的菌液濃度已超出了方法的檢出限。因此，escV、bfpB、stx1、ipaH和invE基因的檢出限是10 CFU/mL；aggR基因的檢出限是102CFU/mL；astA和pic基因的檢出限是103CFU/mL；而stx2A、ipaH和stIb基因，菌液濃度<102CFU/mL時(shí)還可觀察到擴(kuò)增曲線，且線形較好(見表4)。

2.5 4種試劑盒與普通PCR法的試劑盒比對試驗(yàn)

根據(jù)GB 4789.6—2016標(biāo)準(zhǔn)使用多重普通PCR檢測

圖2 5種致瀉大腸埃希氏菌攜帶毒力基因的擴(kuò)增圖譜

菌株名稱escVbfpBstx1stx2AipaHinvEltstIastIbastAaggRpicEPEC++----------STEC+-++--------EHEC+-++--------EIEC----++------ETEC------+++---EAEC---------+++大腸埃希氏O157:H7+-----------沙門氏菌------------副溶血性弧菌------------單增李斯特氏菌------------阪崎腸桿菌------------

? “+”表示擴(kuò)增出曲線；“-”表示沒有擴(kuò)增出曲線。

圖3 4個(gè)試劑盒在不同菌液濃度下的擴(kuò)增圖譜

濃度/(CFU·mL-1)escVbfpBstx1stx2AipaHinvE108//////107//18.5±0.4418.1±0.17//10616.3±0.2017.6±0.3622.1±0.5621.4±0.7216.9±0.1719.1±0.5310519.1±0.4620.4±0.7025.6±0.9624.9±0.5320.2±0.1022.3±0.4410422.8±0.6224.2±0.7829.5±0.5329.0±0.5623.7±0.4426.6±0.1710326.6±0.3029.5±0.5332.4±0.6230.3±0.2626.7±0.4629.7±0.7210231.1±0.7233.1±0.5635.8±0.8934.1±0.3629.9±0.9634.5±0.2610///35.5±0.6132.6±0.36/濃度/(CFU·mL-1)ltstIastIbastAaggRpic108///16.4±0.1019.4±0.1717.7±0.17107///19.4±0.2622.8±0.2621.0±0.6110618.7±0.3516.8±0.8716.6±0.2624.5±0.6624.0±0.5625.2±0.2610521.7±0.3520.0±0.4019.5±0.3529.1±0.1726.9±0.6929.1±0.2010425.0±0.2623.6±0.5323.2±0.2632.6±0.1728.1±0.5032.3±0.1710329.1±0.1727.4±0.6126.6±0.17/32.4±0.52/10232.1±0.3531.5±0.3631.1±0.30///10//35.1±0.17///

試劑盒對5種致瀉大腸埃希氏菌致病菌進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陽性(圖4)，說明本研究建立的方法檢測結(jié)果與GB 4789.6—2016標(biāo)準(zhǔn)中多重普通PCR檢測的結(jié)果一致。根據(jù)GB 4789.6—2016標(biāo)準(zhǔn)使用多重普通PCR檢測試劑盒將5種致瀉大腸埃希氏菌致病菌的所有毒力基因電泳跑膠出相應(yīng)的DNA條帶(見圖4)，在整個(gè)過程中耗時(shí)較長、操作較繁瑣，也進(jìn)一步驗(yàn)證了設(shè)計(jì)的4種試劑盒毒力基因的擴(kuò)增結(jié)果與多重普通PCR檢測試劑盒相一致。

2.6 對污染較嚴(yán)重和人工污染樣品進(jìn)行檢測

對抽查和委托檢驗(yàn)的肉類、奶的樣品，以及動(dòng)物腹瀉物和人工污染樣品等40份樣品用人工合成的4種試劑盒法和商品化的多重普通PCR檢測試劑盒分別進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示2種方法的結(jié)果相一致，進(jìn)一步表明建立的4種試劑盒方法操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高，具有良好的實(shí)用性。

圖4 5種致瀉大腸埃希氏菌多重普通PCR 檢測試劑盒圖譜

Figure 4 Multiple common PCR detection kits were used to detect five strains of diarrheagenicEscherichiacoli

表5 不同的方法對樣品的檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本研究采用TaqMan探針技術(shù)的多重PCR技術(shù)，針對5種致瀉大腸埃希氏菌的保守序列，設(shè)計(jì)并合成了相關(guān)12對特異性的毒力基因的引物與熒光探針，根據(jù)設(shè)計(jì)的條件和原理建立了4種PCR擴(kuò)增試劑盒，采用四色熒光PCR技術(shù)在全封閉的擴(kuò)增體系中對5種致瀉大腸埃希氏菌檢測，其中1號試劑盒包括EPEC 與EHEC 兩種菌，2號試劑盒包括EIEC；3號試劑盒包括ETEC；4號試劑盒包括EAEC。4種試劑盒不僅可以單獨(dú)檢測1種致瀉大腸埃希氏菌，也可以同時(shí)檢測5種致瀉大腸埃希氏菌，檢測的靈敏度最高達(dá)到10 CFU/mL，檢測范圍達(dá)到108～102CFU/mL，說明該方法有較高的靈敏度；使用本研究建立的檢測方法對常見食源性致病菌進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示常見的食源性致病菌均檢測為陰性，無擴(kuò)增曲線，只有5種致瀉大腸埃希氏菌和大腸埃希氏O157：H7有擴(kuò)增曲線，說明使用本研究建立的檢測方法有較強(qiáng)的特異性；對抽查和委托檢驗(yàn)的40份樣品用該方法和商品化的多重普通PCR檢測試劑盒分別進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示2種方法的結(jié)果相一致，進(jìn)一步表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度；并且可以降低檢測成本，減輕工作量，避免致癌物給工作人員帶來的危害。

本研究克服了以往常規(guī)檢測中選擇性分離、生化鑒定和血清學(xué)鑒定中的試驗(yàn)周期耗時(shí)較長、操作較繁瑣、人為因素干擾等造成檢測結(jié)果不確定和漏檢的缺點(diǎn)；也克服了使用普通PCR中配制擴(kuò)增體系繁多、跑凝膠電泳、操作較繁瑣和引物特異性不高等缺點(diǎn)；uidA基因?yàn)榇竽c埃希氏菌特異性基因[23]，可以作為初篩去除很多不含大腸埃希氏的樣品。但是在使用4種試劑盒研究其特異性時(shí)，選取的食源性致病菌種類較少，涉及的菌種數(shù)量面不夠廣泛；使用4種試劑盒對污染較嚴(yán)重和人工污染樣品進(jìn)行檢測時(shí)，對檢測的樣品量不夠，還需再多的搜集相關(guān)樣品進(jìn)行檢測來驗(yàn)證4種試劑盒的準(zhǔn)確性，拓展它們的實(shí)用性；在多重反應(yīng)中對每對引物和探針的濃度比列會(huì)對靈敏度產(chǎn)生影響，系統(tǒng)地優(yōu)化反應(yīng)體系，可以在增菌液中目的菌不多或者提取的核酸模板量不多的情況下，也可以很準(zhǔn)確地檢測出來，從而提高陽性檢出率[24]。