雙氯芬酸鈉大鼠在體腸吸收的研究

石英杰 王銳利 張麗鋒 任國(guó)蓮 張淑秋*

（山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)教研室，山西 太原 030001）

雙氯芬酸鈉（diclofenac sodium，DS）為鄰氨基苯甲酸衍生物[1]，在臨床上用于緩解急慢性關(guān)節(jié)炎、急慢性強(qiáng)直性脊柱炎、肩周炎、滑囊炎、急性的輕、中度疼痛及各種原因引起的發(fā)熱等。該藥在體內(nèi)的半衰期短[2]（t1/2約1.5 h），血藥濃度低，須頻繁給藥，因此研究和開(kāi)發(fā)其緩釋制劑更符合臨床治療的要求。

在進(jìn)行藥物處方研究時(shí)，可以藥物腸道吸收特征為指導(dǎo)。本文采用在體單灌流法研究雙氯芬酸鈉的腸吸收動(dòng)力學(xué)特征，闡述其可能的吸收機(jī)制，以期為藥物的處方設(shè)計(jì)提供生物藥劑學(xué)依據(jù)。

1 材 料

試劑：雙氯芬酸鈉（寧波斯邁克制藥有限公司、批號(hào)：DOSR-1504015）；烏來(lái)糖（批號(hào)1203147，上海展云化工有限公司）；乙腈、甲醇（天津市科盟化工工貿(mào)有限公司、色譜純）；其他試劑均為分析純。

儀器：Agilent1200 高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫公司），F(xiàn)A1104N 電子天平，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海浦東物理光學(xué)儀器廠(chǎng)），HL-2S恒流泵（上海嘉鵬科技有限公司）。

動(dòng)物：健康雄性Wistar大鼠，重量（230±20）g（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

灌流液：Krebs-Ringer 試劑：稱(chēng)取NaCl 7.8 g、NaHCO31.37 g、KCl 0.35 g、NaH2PO40.32 g、CaCl20.37 g，MgCl20.02 g、葡萄糖1.48g加蒸餾水至1000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.4。

2 方法與結(jié)果

2.1 灌流液中藥物的方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件：色譜柱：Aglient HC-C8（4.6 mm×250 mm，5 L），流動(dòng)相：乙腈-0.4%乙酸銨溶液-三乙胺（45∶55∶0.2），流速：0.7 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：20 L。tR為6.9 min。

2.1.2 專(zhuān)屬性考察：用新配制的Krebs-Ringer液對(duì)小腸灌流。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件操作，考察方法專(zhuān)屬性，結(jié)果見(jiàn)圖1，表明雙氯芬酸鈉在該方法下專(zhuān)屬性較好。

圖1 腸灌流液的色譜圖：A-空白灌流液；B-含藥灌流液；1-雙氯芬酸鈉

2.1.3 線(xiàn)性關(guān)系實(shí)驗(yàn)：精密稱(chēng)取約10 mg雙氯芬酸鈉用100 mL空白灌流液定容，配制成質(zhì)量溶度為100 g/mL的溶液，分別移取該溶液適量于10 mL的容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1、5、10、15、25 g/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量為20 L，記錄雙氯芬酸鈉峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得方程：A=68.021C+20.41（R2=0.9998，n=5）。結(jié)果表明：雙氯芬酸鈉在1～25 g/mL的范圍內(nèi)，有較好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.4 方法的精密度試驗(yàn)：用空白灌流液分別配制質(zhì)量濃度為5、10、15 g/mL的雙氯芬酸鈉溶液，3種質(zhì)量濃度的溶液分別在1 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次得日內(nèi)精密度，3種溶液每天進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣3 d得日間精密度，低（5 g/mL）、中（10 g/mL）、高（15 g/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度RSD分別為0.13%、0.06%、0.09%，日間精密度RSD分別為0.84%、0.61%、0.75%?？烧f(shuō)明該方法精密度良好。

2.1.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)：用配制好的質(zhì)量濃度為5、10、15 g/mL的雙氯芬酸鈉溶液，以“2.1.1”項(xiàng)下條件操作，記錄峰面積，求得雙氯芬酸鈉的回收率；結(jié)果表明雙氯芬酸鈉在上述低、中、高3種質(zhì)量濃度下回收率結(jié)果分別為（100.67±1.62）%、（99.0±1.71）%、（99.51±0.60）%，結(jié)果表明該測(cè)定方法準(zhǔn)確。

2.1.6 藥物的穩(wěn)定性試驗(yàn)：用Krebs-Ringer液對(duì)各腸段灌流，收集流出液，以此流出液配制含藥濃度為10 g/mL的溶液，置于37 ℃的水浴中，每30 min取樣1次，共取樣6次，持續(xù)180 min，求得雙氯芬酸鈉的濃度，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD≤2%，表明雙氯芬酸鈉在灌流液中至少可以穩(wěn)定3 h。

2.2 大鼠在體腸吸收實(shí)驗(yàn)[3-5]：將實(shí)驗(yàn)前禁食12 h、體質(zhì)量約250 g的大鼠用0.2 g/mL的烏拉坦進(jìn)行腹腔注射麻醉（0.8 g/kg），并固定于手術(shù)板上。沿腹中線(xiàn)剪開(kāi)大鼠腹腔（約3 cm），膽總管插管引流膽汁，找出待考察腸段，在該腸段的上下兩端各切一小口，插入直徑約為0.3 cm的玻璃管，用手術(shù)線(xiàn)扎緊，用預(yù)熱至37 ℃的生理鹽水將小腸內(nèi)容物沖洗干凈。用浸有生理鹽水的紗布將傷口覆蓋保濕（實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不停的滴加預(yù)熱置37 ℃的生理鹽水），用紅外燈照射為大鼠取暖，以維持大鼠體溫。

將含藥 K-R液，預(yù)熱至37 ℃，以1 mL/min灌流腸段20 min，然后將流速降至0.2 mL/min，并以此流速維持30 min使吸收達(dá)到平穩(wěn)，輸入端用裝有含藥K-R液的EP管（質(zhì)量已稱(chēng)）灌入，輸出端用空EP管（質(zhì)量已稱(chēng)）接收，每間隔15 min迅速替換掉供藥的EP管和收集的EP管，并稱(chēng)重，計(jì)算供藥EP管與收集EP管各自的質(zhì)量差值，于計(jì)時(shí)后2 h停止采集灌流液，共收集7~8個(gè)點(diǎn)，灌流結(jié)束后將大鼠處死，將灌流的腸段取出，沖洗干凈后剪開(kāi)，置于坐標(biāo)紙上，測(cè)量其長(zhǎng)度和內(nèi)徑。

實(shí)驗(yàn)考察的大鼠腸段的選擇如下；十二指腸段自幽門(mén)1 cm處開(kāi)始，空腸段自幽門(mén)15 cm處開(kāi)始，回腸段自盲腸上行20 cm處開(kāi)始，結(jié)腸段緊鄰盲腸至直腸，各待測(cè)腸段截取長(zhǎng)度約為10 cm。

2.3 數(shù)據(jù)處理：采用重量法[6-7]按以下公式計(jì)算藥物吸收速率常數(shù)（Ka）和表觀吸收系數(shù)（Papp）：

Qin和Qout分別為灌入液和收集液的體積（mL，根據(jù)測(cè)得質(zhì)量按密度為1折算成體積）；Cin和Cout分別為腸道輸入端和輸出端灌流液中藥物的質(zhì)量濃度（μg/mL）；r為待考察腸段的內(nèi)徑半徑；l為待考察腸段的長(zhǎng)度； Q為灌流體積流量；V （mL，V=πr2l ）為灌流腸段的體積。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），其中組間差異經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)分析，結(jié)果以（-x±s）表示，判據(jù)為當(dāng)P<0.05時(shí)結(jié)果具有顯著性差異，當(dāng)P>0.05時(shí)結(jié)果沒(méi)有顯著性差異。

2.4 結(jié)果

2.4.1 雙氯芬酸鈉以不同質(zhì)量濃度灌流小腸考察腸的吸收動(dòng)力學(xué)：分別用不同質(zhì)量濃度的雙氯芬酸鈉灌流液對(duì)大鼠小腸進(jìn)行灌流，比較雙氯芬酸鈉供試液在不同濃度條件下的Ka和Papp值，結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)分析可知，雙氯芬酸鈉在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的小腸吸收參數(shù)Ka和Papp差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。雙氯芬酸在5~20 g/mL濃度范圍內(nèi)的小腸吸收無(wú)濃度依賴(lài)性，說(shuō)明主要以被動(dòng)擴(kuò)散機(jī)制吸收進(jìn)入體循環(huán)。

表1 不同濃度的雙氯芬酸鈉的吸收參數(shù)（n = 5，±s）

表1 不同濃度的雙氯芬酸鈉的吸收參數(shù)（n = 5，±s）

C(g/mL) Ka(10-2/min) Papp(10-3/cm/min)5 4.56±0.18 6.36±0.011 10 4.32±0.15 6.20±0.072 20 4.76±0.21 6.92±0.092

2.4.2 雙氯芬酸鈉以同一質(zhì)量濃度灌流大鼠不同腸段考察腸的吸收動(dòng)力學(xué)：灌流液的質(zhì)量濃度為10 g/mL，待測(cè)腸段的選擇如“2.2項(xiàng)下”所述，以同一質(zhì)量濃度灌流不同腸段，比較不同腸段的Ka和Papp值。結(jié)果見(jiàn)表2，經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)分析可知，除回腸的Ka、Papp值與十二指腸、空腸和結(jié)腸之間存在顯著性差異（P<0.05）外，其他各組之間比較均沒(méi)有顯著性差異。表明藥物吸收最快的部位是回腸，其次是空腸、結(jié)腸、十二指腸。不同腸段的吸收趨勢(shì)為：回腸＞空腸＞結(jié)腸≈十二指腸。Papp值均＞1.2 ×10-3cm/s1，表明雙氯芬酸鈉在小腸全段的吸收均較好[8-9]。

表2 雙氯芬酸鈉在不同腸段的吸收參數(shù)（n = 5，±s）

表2 雙氯芬酸鈉在不同腸段的吸收參數(shù)（n = 5，±s）

注：與回腸組比較，1)P<0.05

Intestine Ka(10-2/min) Papp(10-3/cm/min)Duodenum 5.28±0.681) 2.86±0.331)Jejunum 6.42±0.951) 6.34±0.32 Ileum 8.47±0.69 6.73±0.27 Colon 5.89±0.511) 5.40±0.571)

2.4.3 雙氯芬酸鈉以不同灌流體積流量灌流小腸考察腸的吸收動(dòng)力學(xué)：以同一質(zhì)量濃度的含藥灌流液（10 g/mL），以不同的灌流速度（0.2、0.4、0.8 mL/min）對(duì)大鼠小腸進(jìn)行灌流。比較不同灌流速度下藥物的Ka和Papp值。見(jiàn)表3，結(jié)果表明：經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)分析可知，在各體積流量下的Ka和Papp比較差異均顯著（P＜0.05），利用灌流體積流量的改變來(lái)模擬小腸不同的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明小腸在不同的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下對(duì)雙氯芬酸鈉的吸收產(chǎn)生一定的影響。

表3 雙氯芬酸鈉在不同體積流量下的吸收參數(shù)（n = 5，±s）

表3 雙氯芬酸鈉在不同體積流量下的吸收參數(shù)（n = 5，±s）

注：與體積流量（0.2 mL/min）組相比較，1)P<0.05；與體積流量（0.4 mL/min）組相比較，2)P<0.05

perfusion(mL/min) Ka(10-2/min) Papp(10-3/cm/min)0.2 4.32±0.152) 6.20±0.0722)0.4 5.88±0.141) 8.56±0.0741)0.8 6.92±0.181)2) 9.22±0.0581)

3 討 論

3.1 用于評(píng)價(jià)藥物腸道吸收情況的動(dòng)物模型有很多，目前常用的方法主要有“在體循環(huán)法”和“單向灌流法”。在體循環(huán)法中較高的灌流速度，可引起腸黏膜的脫落，造成損傷，而較長(zhǎng)的灌流時(shí)間，會(huì)影響藥物的代謝，更有可能導(dǎo)致一些藥物的降解，現(xiàn)已較少應(yīng)用。相比之下，單向灌流法灌流速度低（約0.2 mL/min），灌流時(shí)間短，并且與給藥后藥物接觸腸道的環(huán)境較為接近。因此為提高實(shí)驗(yàn)測(cè)定的準(zhǔn)確度。本實(shí)驗(yàn)采用了“單向灌流法”評(píng)價(jià)雙氯芬酸鈉在腸道的吸收情況。

3.2 大鼠在體腸吸收實(shí)驗(yàn)過(guò)程中腸道對(duì)水分的吸收或分泌會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定產(chǎn)生一定的影響，因此需要校正灌流液的體積，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前多采用的方法有酚紅法與重量法，然而在灌流過(guò)程中酚紅可能會(huì)被腸道吸收，并且還可能影響腸道的吸收環(huán)境。因此本實(shí)驗(yàn)引入重量法進(jìn)行灌流液的體積校正，本法操作簡(jiǎn)單，并且可以較真實(shí)客觀地反映腸道水分吸收情況。

3.3 由于大鼠的生理結(jié)構(gòu)中的輸膽總管開(kāi)口于十二指腸的上端，分泌的膽汁直接進(jìn)入十二指腸。膽汁的成分很復(fù)雜，其中的有機(jī)成分膽鹽、膽固醇和卵磷脂具有乳化劑的作用，可影響一些藥物的代謝[10]。同時(shí)進(jìn)入十二指腸內(nèi)的膽汁可通過(guò)腸肝循環(huán)影響腸道中的藥物濃度。因此為排除膽汁因素對(duì)藥物測(cè)定的影響，本實(shí)驗(yàn)將膽汁引流，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.4 一般認(rèn)為大鼠小腸全腸段的Papp＜1.8×10-4cm/min，或Papp＞1.2×10-3cm/min時(shí)，表明藥物難吸收或完全吸收。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果雙氯芬酸鈉的有效滲透吸收順序?yàn)椋嚎漳c≈回腸＞結(jié)腸＞十二指腸。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明雙氯芬酸鈉在大鼠各腸段均有較好吸收，適于制備成緩釋給藥系統(tǒng)。