茶樹(shù)胡蘿卜素合成關(guān)鍵基因CsLCYb和CsLCYe的克隆與功能鑒定

劉關(guān)華，楊梅，付建玉

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茶樹(shù)胡蘿卜素合成關(guān)鍵基因和的克隆與功能鑒定

劉關(guān)華1,2,3，楊梅1,2,3，付建玉1,2*

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008 3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

胡蘿卜素是茶樹(shù)葉片色素重要的組分之一，具有參與光合作用、保護(hù)光合系統(tǒng)的功能。從茶樹(shù)葉片轉(zhuǎn)錄組中獲得兩個(gè)胡蘿卜素合成關(guān)鍵基因：番茄紅素--環(huán)化酶基因（）和番茄紅素--環(huán)化酶基因（），它們分別含含1?515?bp和1?524?bp的開(kāi)放閱讀框，編碼504和507個(gè)氨基酸殘基，與其他植物的同源基因高度相似。利用多基因串聯(lián)表達(dá)證明能夠?qū)⒎鸭t素環(huán)化成胡蘿卜素，而則無(wú)此活性。通過(guò)ELISA分析胡蘿卜素生成效率，發(fā)現(xiàn)含有表達(dá)載體的菌落能夠產(chǎn)生大量胡蘿卜素，與陰性對(duì)照差異極顯著，而含有表達(dá)載體的菌落則與陰性對(duì)照一致，無(wú)胡蘿卜素產(chǎn)生。這與茶樹(shù)中胡蘿卜素的種類和含量水平一致，說(shuō)明茶樹(shù)主要是通過(guò)LCYb途徑產(chǎn)生胡蘿卜素。qRT-PCR分析表明，在黃化品種中黃2號(hào)的不同葉位中表達(dá)水平與其黃化程度呈正相關(guān)，與胡蘿卜素含量水平相一致，并且該基因在正常葉色品種龍井43和中黃2號(hào)的相對(duì)表達(dá)結(jié)果也符合這一規(guī)律。這充分證明在黃化茶樹(shù)葉片的胡蘿卜素合成和葉色變化過(guò)程中扮演了重要的角色。本研究闡明了茶樹(shù)胡蘿卜素合成的關(guān)鍵基因和主要途徑，為揭示茶樹(shù)黃化的分子機(jī)理提供了重要的遺傳基礎(chǔ)。

茶樹(shù)；番茄紅素環(huán)化酶；胡蘿卜素；基因表達(dá)；黃化

高等植物葉片中的色素主要分為4大類：類黃酮化合物，以花色素苷類為主；甜菜紅素類，包括甜菜黃素和-花青苷，這類物質(zhì)僅存在于石竹目植物中；類胡蘿卜素，包括葉黃素和胡蘿卜素；葉綠素類，主要包括葉綠素a和葉綠素b。正常綠色葉片中葉綠素含量高于其他色素含量，葉片呈綠色[1-2]。當(dāng)不同色素含量比率發(fā)生變化時(shí)，葉片顏色也隨之發(fā)生改變。如類胡蘿卜素較葉綠素含量高時(shí)，葉片就會(huì)呈現(xiàn)黃色[3-4]。胡蘿卜素廣泛存在于植物葉綠體中，是人類和動(dòng)物膳食中維生素A的前體物質(zhì)，且廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、動(dòng)物飼料等行業(yè)[5-6]，其氧化裂解后形成的脫輔基類胡蘿卜素可以生成植物激素，如脫落酸和獨(dú)腳金內(nèi)酯，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育[7-8]。在葉色特異植物中，葉片色素組成比例的變化，是植物適應(yīng)周?chē)h(huán)境和保護(hù)光合系統(tǒng)的策略[9]。在光合作用的過(guò)程中，光合系統(tǒng)生成的氧化性很強(qiáng)的單線態(tài)氧可被類胡蘿卜素有效地淬滅，保護(hù)光合系統(tǒng)[5]。

胡蘿卜素為四萜類化合物，其主要通過(guò)MEP（甲基赤蘚醇-4-磷酸途徑）途徑合成[10-13]：IPP在DXS（1-脫氧--木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶）的催化下合成1-脫氧--木酮糖-5-磷酸，再由DXR（脫氧木酮糖-5-磷酸合酶）、CMK（4-二磷酸胞苷-2--甲基赤蘚糖激酶）、MCS（2-甲基赤蘚糖-2,4-環(huán)二磷酸合酶）、HDS（1-羥基-2-甲基-2-（）-丁烯基4-二磷酸合酶）經(jīng)過(guò)一系列催化，合成胡蘿卜素前體物質(zhì)香葉基香葉基焦磷酸（GGPP）[14]，兩分子GGPP在八氫番茄紅素合成酶的催化下縮合成八氫番茄紅素（phytoene），phytoene在PDS（八氫番茄紅素脫氫酶）和ZDS（-胡蘿卜素脫氫酶）的催化下，生成番茄紅素（lycopene），lycopene在番茄紅素--環(huán)化酶（-LCY）催化下，生成-胡蘿卜素和-胡蘿卜素，或經(jīng)番茄紅素--環(huán)化酶（-LCY）作用生成-胡蘿卜素[15]。

細(xì)菌、藻類和高等植物均存在番茄紅素環(huán)化酶（LCY），它們分成三個(gè)類型：第一類是細(xì)菌類的CrtY、藻類和植物的CrtL型（包括-LCY），植物的-LCY和細(xì)菌的番茄紅素-單環(huán)化酶也屬于這一類型；第二類是細(xì)菌的CrtYc和CrtYd，以及真菌類的CrtYB型；第三類是僅在綠硫菌和藍(lán)藻細(xì)菌的CruA/CruP型[16-17]。多基因串聯(lián)表達(dá)是研究植物胡蘿卜素合成途徑相關(guān)基因功能的有效方法之一，即在一個(gè)載體中串聯(lián)胡蘿卜素合成途徑的關(guān)鍵基因，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，通過(guò)觀察菌落的顏色可以直接鑒定各基因的功能[18-20]。

茶葉中總胡蘿卜素含量約占鮮葉干重的0.06%，包括-胡蘿卜素、-胡蘿卜素和-胡蘿卜素[21]。中黃2號(hào)等葉色黃化的茶樹(shù)是近年來(lái)選育的特異新品種，因其特殊的葉色和滋味、香氣而備受關(guān)注，黃化茶樹(shù)葉片中類胡蘿卜素的總量較正常品種（福鼎大白）高，且相關(guān)基因的表達(dá)量也較福鼎大白高[22-23]。茶葉中關(guān)于胡蘿卜素的研究主要集中在含量的測(cè)定及其不同品種間的差異[24]，無(wú)相關(guān)分子機(jī)理的研究報(bào)道。本文首次獲得了茶樹(shù)胡蘿卜素合成的兩個(gè)關(guān)鍵基因：茶樹(shù)番茄紅素--環(huán)化酶基因（）和番茄紅素--環(huán)化酶基因（），利用體外胡蘿卜素合成途徑重構(gòu)方法，構(gòu)建了多基因串聯(lián)表達(dá)載體，通過(guò)顯色反應(yīng)和胡蘿卜素含量測(cè)定明確了兩個(gè)基因的生化功能，并分析了其在中黃2號(hào)茶樹(shù)不同葉位中的表達(dá)情況，為解析黃化茶樹(shù)葉色變異的分子機(jī)理，發(fā)掘利用特異茶樹(shù)種質(zhì)資源提供了重要理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 茶樹(shù)CsLCYb和CsLCYe基因克隆

龍井43葉片轉(zhuǎn)錄組篩選得到的[25]Unigene與其他物種蛋白序列比對(duì)選用NCBI的Blastp（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），使用Primer primer 6.0根據(jù)轉(zhuǎn)錄組篩選出來(lái)的兩個(gè)基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)引物（表1）。茶樹(shù)葉片總RNA采用植物多糖多酚總RNA提取試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司，北京）提取，RNA濃度采用NanoDrop1000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）測(cè)定，RNA質(zhì)量采用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。葉片總RNA（100?ng·μL-1）經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT Reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa, Co. Ltd, Dalian, China）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性2?min；98℃變性10?s，56℃退火30?s，68℃延伸2?min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10?min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，131?V電壓電泳25?min，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶，亞克隆至pClone700載體上，采用M13通用引物雙向測(cè)序（杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司）。

表1 茶樹(shù)CsLCYe和CsLCYb基因克隆與表達(dá)引物

1.2 多基因串聯(lián)共表達(dá)載體的構(gòu)建

表達(dá)載體利用pAC-LYC質(zhì)粒為骨架構(gòu)建，該載體上串聯(lián)了番茄紅素合成的3個(gè)關(guān)鍵基因：E（AAA64977.1，合成前體香葉基香葉基焦磷酸GGPP）；B（AAA64982.1，將GGPP催化生成八氫番茄紅素phytoene）；I（AAA64981.1，將八氫番茄紅素脫氫生成番茄紅素lycopene）。在基因兩端引入SacⅠ酶切位點(diǎn)，同時(shí)將基因和pAC-LYC質(zhì)粒用SacI酶切再后插入基因E和I之間區(qū)域，構(gòu)建pAC-LYC-多基因串聯(lián)表達(dá)載體。采用同樣方法，在兩端引入HindⅢ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pAC-LYC-多基因串聯(lián)表達(dá)載體。

1.3 基因表達(dá)與生化功能分析

采用熱激法將pAC-LYC-和pAC-LYC-質(zhì)粒及3個(gè)對(duì)照質(zhì)粒（空白對(duì)照pAC-I：只含1個(gè)番茄紅素合成相關(guān)基因I，菌落無(wú)顏色變化；陰性對(duì)照pAC-LYC：含有番茄紅素合成的3個(gè)關(guān)鍵基因I、B、E，能夠生成番茄紅素而使菌落呈粉紅色；陽(yáng)性對(duì)照pAC-BETA：含有擬南芥胡蘿卜素合成的4個(gè)關(guān)鍵基因：I、B，E、Y，能夠?qū)⒎鸭t素環(huán)化成-胡蘿卜素而使菌落呈橘黃色）分別同時(shí)轉(zhuǎn)入100?μL的DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中[26]，加入1?mL預(yù)冷的LB培養(yǎng)基，在37℃下復(fù)蘇1?h后，均勻涂布于含氯霉素（3.2?mg·mL-1）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)24?h后，室溫下（25℃）避光培養(yǎng)3?d。如果有功能，則能夠?qū)AC-LYC質(zhì)粒編碼的蛋白生成的番茄紅素環(huán)化生成-胡蘿卜素而呈橘黃色，若有功能，則能將pAC-LYC質(zhì)粒編碼的蛋白生成的番茄紅素環(huán)化生成-胡蘿卜素而呈黃色，無(wú)活性則兩者都依然呈現(xiàn)番茄紅素的粉紅色。因此先通過(guò)觀察含有不同質(zhì)粒的菌落顯色變化，再?gòu)暮锌瞻讓?duì)照質(zhì)粒和兩個(gè)茶樹(shù)番茄紅素環(huán)化酶基因質(zhì)粒的菌落中分別隨機(jī)挑取12個(gè)等面積的菌落（各約10?mg），每個(gè)菌落用100?μL PBS的比例稀釋后，測(cè)定其胡蘿卜素含量。菌落胡蘿卜素含量用胡蘿卜素ELISA試劑盒經(jīng)酶標(biāo)儀Rayto RT-6100測(cè)定：先用胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度測(cè)定440~454?nm處的特征吸收峰值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用同樣方法測(cè)定每個(gè)菌落樣品的特征吸收峰值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其胡蘿卜素含量[27-28]。

1.4 CsLCYb和CsLCYe基因在黃化茶樹(shù)葉片中的表達(dá)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CsLCYe和CsLCYb基因克隆與生物信息學(xué)分析

（ADK74376.1）和（KM519983.1）基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)??524?bp和1?515?bp，分別編碼507個(gè)氨基酸殘基和504個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)。NCBI比對(duì)結(jié)果顯示，CsLCYe序列與獼猴桃（PSS20792.1）、映山紅（BAS69437.1）、麻風(fēng)樹(shù)（XP_012076949.1）番茄紅素環(huán)化酶的同源性較高，分別為88%、85%和84%。CsLCYb序列與獼猴桃（PSS33530.1）、映山紅（BAS69436.1）番茄紅素環(huán)化酶和葡萄番茄紅素環(huán)化酶2（AFP28799.1）的同源性較高，分別為91%、91%和89%。

經(jīng)MAGE 7.0蛋白序列分析顯示，CsLCYe和CsLCYb含有植物番茄紅素環(huán)化酶保守的二核苷酸信號(hào)結(jié)合保守區(qū)域（FAD結(jié)合區(qū)域），環(huán)化酶保守結(jié)構(gòu)域1和2，以及帶電保守結(jié)構(gòu)域（圖1）。ExPASy-ProtParam（http://web. expasy. org/protparam）在線分析蛋白理化性質(zhì)[29]顯示，CsLCYe蛋白分子量為59.42?kD，理論等電點(diǎn)pI=7.29；CsLCYb蛋白的分子量為56.67?kD，理論等電點(diǎn)pI=8.3。

采用MAGE 7.0的NJ（Neighbor Joining）法將CsLCYe和CsLCYb與其他植物的同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[30]，結(jié)果顯示，茶樹(shù)的兩個(gè)番茄紅素環(huán)化酶與獼猴桃的番茄紅素環(huán)化酶聚在了同一支上（圖2）。茶樹(shù)與獼猴桃同屬山茶目植物，最近公布的茶樹(shù)基因組的研究結(jié)果也顯示，茶樹(shù)與獼猴桃的親緣關(guān)系最近[31]，相關(guān)基因聚在一支與物種的分類地位相一致。CsLCYb與黃龍膽科的黃龍膽（ABK57115.1）和椴樹(shù)科的黃麻（OMO58144.1）的LCYb距離的較遠(yuǎn)，CsLCYe與蘭科的鐵皮石斛（PKU88076.1）和石蒜科的水仙LCYe（PKU88076.1）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 基因表達(dá)與功能鑒定

圖3-A為重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。體外多基因串聯(lián)表達(dá)顯示，含有pAC-LYC-的菌落呈粉紅色，與不含胡蘿卜素合成基因的陰性對(duì)照pAC-LYC一致。含有pAC-LYC-的菌落呈橘黃色，與含擬南芥胡蘿卜素合成基因的陽(yáng)性對(duì)照pAC-BETA顏色一樣（圖3-B）。該結(jié)果說(shuō)明，茶樹(shù)的兩個(gè)番茄紅素環(huán)化基因中，只有具有活性，它能將粉紅色的番茄紅素環(huán)化成橘黃色的-胡蘿卜素，而則無(wú)番茄紅素環(huán)化功能，不能生成胡蘿卜素。

為進(jìn)一步驗(yàn)證茶樹(shù)兩個(gè)番茄紅素環(huán)化酶轉(zhuǎn)化生成胡蘿卜素的活性，用ELISA方法分析了含有其表達(dá)質(zhì)粒菌落中的胡蘿卜素含量。分別利用胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線都為：=348.63+1.807?8，2=0.990?1。結(jié)果顯示，含表達(dá)載體的菌落特征吸收峰值與-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品一致，菌落中的-胡蘿卜素平均含量為740.228?mg·mL-1，與陰性對(duì)照相比差異極顯著（<0.01）；含表達(dá)載體的菌落則在-胡蘿卜素特征吸收峰值處無(wú)結(jié)果，測(cè)定其-胡蘿卜素含量與陰性對(duì)照相比無(wú)顯著差異（>0.05）（圖4）。該生化測(cè)定結(jié)果充分表明，在體外具有將番茄紅素環(huán)化成-胡蘿卜素的功能，酶活性較高，而則無(wú)環(huán)化番茄紅素的功能。

注：AtLCYe：擬南芥番茄紅素-ε-環(huán)化酶；AtLCYb：擬南芥番茄紅素-β-環(huán)化酶

注：CsLYCe：茶樹(shù)；AcLYCe：獼猴桃；QsLYCe：栓皮櫟；VvLYCe：葡萄；ToLYCe：山麻黃；IbLYCe：甘薯；MnLYCe：?？疲籇cLYCe：胡蘿卜；EuLYCe：銀葉胡頹子；FaLYCe：草莓；CmLYCe：甜瓜；GlLYCe：黃龍膽；NtLYCe：煙草；AtLYCe：擬南芥；AaLYCe：金盞菊；CoLYCe：長(zhǎng)蒴黃麻；NtaLYCe：水仙；SoLYCe：菠菜；GsLYCe：野生大豆；HiLYCe：紫花風(fēng)鈴；RcLYCe：蓖麻；LsLYCe：萵苣；AcoLYCe：菠蘿；DcaLYCe：鐵皮石斛；AcLYCB:獼猴桃；QsLYCB：栓皮櫟；HiLYCb：紫花風(fēng)鈴；McLYCb：博落回；CcLYCB：麻黃；NaLYCB：煙草；DhLYCB：牛耳草；DcLYCB：胡蘿卜；GsLYCB：野生大豆；MnLYCB：桑樹(shù)；IbLYCB：紅薯；RjLYCB：杜鵑；ToLYCB：蒲公英；DzLYCB：榴蓮；MdLYCB：蘋(píng)果；ElLYCB：透骨草；RrLYCB：玫瑰；CsLYCB：茶樹(shù)；VvLYCB：葡萄；DkLYCB：柿樹(shù)；ClLYCB：西瓜；GlLYCB：黃龍膽；CpLYCB：番木瓜；AaLYCB：夏側(cè)金盞花；CsiLYCB：甜橙

2.3 CsLCYb和CsLCYe基因在黃化茶樹(shù)葉片中的表達(dá)分析

表型觀察發(fā)現(xiàn)，黃化期的中黃2號(hào)頂芽至第二葉為黃色，第三葉完全變成了綠色[32]。為進(jìn)一步確定和在中黃2號(hào)不同葉位的表達(dá)量，以qRT-PCR方法測(cè)定了兩個(gè)基因在中黃2號(hào)黃化期的頂芽、頂芽下第一葉、第二葉、第三葉的表達(dá)譜，以轉(zhuǎn)綠程度最高的第三葉為對(duì)照。結(jié)果顯示，和在第一葉中表達(dá)量最高，分別是第三葉的13.50倍和6.99倍，其中，在第一葉中的表達(dá)量較第三葉差異顯著（<0.05）；而在第二葉和頂芽的表達(dá)水平較為接近，其表達(dá)量分別是第三葉的6.62倍和6.43倍；在頂芽的表達(dá)量為第三葉的3.94倍，第二葉的表達(dá)量?jī)H為第三葉的1.58倍（圖5）。相同葉位基因表達(dá)結(jié)果顯示，的表達(dá)量較高。

注：A. pAC-LCY重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。CrtE：香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因；CrtI：番茄紅素合成酶基因；CrtB：八氫番茄紅素合成酶基因；CsLCYe和CsLCYb：茶樹(shù)番茄紅素環(huán)化酶基因。B. 粉紅色菌落：CsLCYe；黃色菌落：CsLCYb和pAC-BETA；白色菌落：pAC-CrtI空白對(duì)照。pAC-BETA：番茄紅素-β-環(huán)化酶陽(yáng)性對(duì)照

注：與對(duì)照相比，**：P<0.01

在確定了具有生化活性的基礎(chǔ)上，測(cè)定了該基因在龍井43和中黃2號(hào)不同葉位的表達(dá)譜。結(jié)果顯示，該基因在中黃2號(hào)黃化葉位的相對(duì)表達(dá)量均高于龍井43，在黃化程度較高的第一葉（<0.05）和第二葉（<0.05）差異顯著，轉(zhuǎn)綠的第三葉的表達(dá)水平則和龍井43基本一致（圖6）。

注：與第三葉相比，*：差異顯著（P<0.05）

注：*：差異顯著（<0.05）

Note: *: The difference is statistically significant (<0.05)

圖6在頂芽不同葉位的相對(duì)表達(dá)量

Fig. 6 Relative expression level ofin terminal bud and different leaves

3 討論

大多數(shù)植物的LCYe僅可以催化線性的番茄紅素生成單環(huán)的-胡蘿卜素，-胡蘿卜素在LYCb的進(jìn)一步催化下生成含-環(huán)和-環(huán)的-胡蘿卜素，而LCYb則能獨(dú)立地將番茄紅素環(huán)化成-胡蘿卜素，也能將-胡蘿卜素環(huán)化成-胡蘿卜素和-胡蘿卜素[27,33]。植物的LCYe和LCYb的底物都是番茄紅素，因此其結(jié)合底物的結(jié)構(gòu)域和穩(wěn)定反應(yīng)中間產(chǎn)物的活性位點(diǎn)高度相似[34-35]。本研究分離得到的茶樹(shù)兩個(gè)番茄紅素環(huán)化酶CsLCYe和CsLCYb，其序列高度相似，含有與其他植物同源蛋白一致的保守結(jié)構(gòu)域（圖1和圖2）。LCYe/LCYb蛋白的比例也一直被認(rèn)為是控制植物-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃素等的生物合成及其含量比例的基礎(chǔ)[36]。茶樹(shù)新梢中含有-胡蘿卜素、-胡蘿卜素和-胡蘿卜素，未發(fā)現(xiàn)單環(huán)的-胡蘿卜素，其中-胡蘿卜素含量占了茶葉總類胡蘿卜素的80%[21]。在胡蘿卜素合成相關(guān)基因的串聯(lián)表達(dá)反應(yīng)中，含番茄紅素的菌落呈粉紅色，而產(chǎn)生胡蘿卜素的菌落則呈黃色或橘黃色[15]，因此通過(guò)顏色變化可直觀的判定基因的功能。本研究通過(guò)多基因串聯(lián)反應(yīng)證明了茶樹(shù)CsLCYb具有將番茄紅素環(huán)化成-胡蘿卜素的功能，ELISA測(cè)定其產(chǎn)物與-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品特征吸收峰值一致，且酶活性較高。說(shuō)明是茶樹(shù)中生成胡蘿卜素的關(guān)鍵基因，這與茶樹(shù)中已知的胡蘿卜素種類與含量相吻合。同時(shí)CsLCYe無(wú)生成-胡蘿卜素的活性，而茶樹(shù)中也未發(fā)現(xiàn)單環(huán)的-胡蘿卜素，充分表明CsLCYb將直鏈的番茄紅素兩端環(huán)化形成帶雙環(huán)的-胡蘿卜素是茶樹(shù)中生成胡蘿卜素的主要途徑。

已有研究表明，在黃化茶樹(shù)品種中，頂芽下第一葉的胡蘿卜素含量最高，其次是第二葉，在頂芽和第三葉含量最低[23,37-38]。在中黃2號(hào)不同葉位的相對(duì)表達(dá)水平與該結(jié)果相一致，其表達(dá)量與黃化程度呈正相關(guān)，即頂芽下第一葉表達(dá)量最高，其次是第二葉和頂芽，基本轉(zhuǎn)綠的第三葉表達(dá)量最低。在正常葉色品種龍井43和中黃2號(hào)的相對(duì)表達(dá)量水平也符合這一規(guī)律?；虮磉_(dá)水平分析進(jìn)一步表明，在黃化茶樹(shù)葉片中的胡蘿卜素合成和葉色變化過(guò)程中扮演了重要的角色，它是茶樹(shù)葉片黃化的重要調(diào)控基因。

致謝：感謝開(kāi)國(guó)銀教授提供質(zhì)粒pAC-LYC。

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Cloning and Functional Analysis ofandfor Carotene Biosynthesis in Tea Plant()

LIU Guanhua1,2,3, YANG Mei1,2,3, FU Jianyu1,2*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Key Laboratory of Tea Quality and Safety Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China; 3. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China.

Carotene, participating in photosynthesis and protecting photosynthetic system, is one of the important pigments of tea leaves. Two key genes [lycopene-cyclase gene () and lycopene-cyclase gene ()] of carotene biosynthesis in tea plant were cloned from transcriptome. They are 1?515?bp and 1?524?bp in length, and encode 504 and 507 amino acid residues, respectively. Based on sequences alignment,andare highly conserved as compared with the homologous genes from other plants. Multiple-gene tandem expression indicated thatcan cyclize lycopene to-carotene whilewas inactive. The enzymatic activities of the two genes were further confirmed by ELISA method in. It showed thatwas able to generate a large amount of carotene, which was significantly different from the negative control. However, no carotene was detected in the colonies with the expression plasmid of pAC-LYC-. The type and content of carotene in tea foliage were consistent with previous reports, which proved that carotene was mainly produced by the LCYb pathway in tea plant. The qRT-PCR analysis revealed that the expression level ofin buds and different leaves of Zhonghuang 2 was positively correlated with the degree of chlorisis and the content of carotene. Furthermore, its relative expression in normal cultivar Longjing 43 and chlorisis cultivar Zhonghuang 2 also showed similar pattern. These findings confirmed thatplays a key role in the carotene biosynthesis and leaf color changing in tea plant, which also provided an important genetic basis for uncovering the molecular mechanism of chlorisis in tea cultivars.

tea plant, lycopene cyclase, carotene, gene expression, chlorisis cultivars

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)03-257-10

2019-01-23

2019-02-13

國(guó)家自然科學(xué)基金（31470693，31100503）、浙江省自然科學(xué)基金（LY18C160006）、中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（1610212018004，1610212016017）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）

劉關(guān)華，男，主要從事茶樹(shù)栽培與育種的研究，E-mail: m15079683172@163.com。*通信作者：mybatigoal@mail.tricaas.com