黃連素與miRNA-29b-3p對結(jié)直腸癌細胞增殖和凋亡的影響

李靜，李治國，王花花，袁龍，徐潔

焦作市人民醫(yī)院1消化內(nèi)科，3腫瘤內(nèi)科，河南焦作454150 2河南省腫瘤醫(yī)院普外科，鄭州450000

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率居惡性腫瘤第3位[1]，嚴重威脅人體健康。目前，手術(shù)是結(jié)直腸癌的主要治療方法，但存在出血量多、易感染等缺點；而放療或化療可對患者健康組織產(chǎn)生不良影響[2]。黃連素又稱鹽酸小檗堿，可從黃連、黃檗等傳統(tǒng)中藥材中提取而來，具有止瀉、降血壓和抗氧化等作用[3-4]。目前，越來越多的學者開始關(guān)注黃連素的抗腫瘤作用及潛在作用機制。研究表明，黃連素能夠預(yù)防腫瘤發(fā)生，對肝癌[5]、肺癌[6]、甲狀腺癌[7]等腫瘤細胞增殖、遷移均有抑制作用[8]。研究顯示，不同濃度的黃連素可調(diào)節(jié)甲殼質(zhì)酶蛋白40（Chitinase protein 40，YKL-40）-蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱 AKT）-cyclin D1信號通路可使結(jié)直腸癌細胞周期阻滯在G1期并誘導細胞凋亡[9]，表明黃連素可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子非編碼RNA，由具有特征性發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)的前體加工而成，通常具有關(guān)鍵基因調(diào)節(jié)劑的作用[10]。研究顯示，結(jié)直腸癌組織中miRNA-29b的表達水平低于癌旁組織，且其與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，表明miRNA-29b在結(jié)直腸癌進展中發(fā)揮重要作用[11]。本研究探討黃連素和miRNA-29b-3p對結(jié)直腸癌細胞增殖和凋亡的影響，分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

人正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460、人結(jié)直腸癌細胞株HCT-116和Caco-2均購自美國模式菌種收集中心；黃連素（純度≥98%）、膜聯(lián)蛋白V（AnnexinV）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自天根生化科技有限公司；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）溶液購自美國Biotrin公司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，7500型實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀購自美國Life Technologies公司，細胞培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific公司，β-actin、miRNA-29b-3p引物均購自北京六合華大基因科技有限公司，miRNA-NC、miRNA-29b-3p mimics、anti-miRNA-NC、anti-miRNA-29b-3p均購自上海吉瑪公司，NanoDrop微量核酸測定儀、流式細胞儀均購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)方法采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)NCM460、HCT-116和Caco-2細胞，每48 h更換1次培養(yǎng)基。在細胞融合度約為80%時，采用0.25%胰蛋白酶消化1 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）重懸細胞，進行細胞培養(yǎng)。

1.2.2 qRT-PCR法檢測miRNA-29b- 3 p的相對表達量 取NCM460、HCT-116和Caco-2細胞，加入Trizol試劑提取總RNA，采用NanoDrop微量核酸測定儀檢測RNA樣品濃度，然后按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，避光配制反應(yīng)體系，每個樣品重復3次，置于7500型實時熒光qRT-PCR儀上擴增。以β-actin為內(nèi)參，所用引物及序列如下：β-actin正向引物為5'-TGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3'，反向引物為5'-TCGGCCACATT GTGAACTTT-3'；miRNA-29b-3p 正向引物為5'-GCGTAGCACCATTTGAAATCA-3'，反向引物為5'-CGAGGAAGAAGACGGAAGAAT-3'；以2-△△Ct法計算NCM460、HCT-116和Caco-2細胞以及黃連素干預(yù)48 h后HCT-116細胞中miRNA-29b-3p的相對表達量，取miRNA-29b-3p相對表達量較低（即對miRNA-29b-3p相對表達量的變化最敏感）的HCT-116細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 MTT法檢測細胞存活情況取HCT-116細胞（對miRNA-29b-3p相對表達量的變化最敏感）接種于96孔板，每孔1×105個細胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h。分別加入0、25、50、100、150和200 μmol/L的黃連素，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，每組設(shè)置6個復孔。采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，每組設(shè)置6個復孔。孵育4 h，棄上清液，每孔加150 μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），振蕩反應(yīng)10 min，采用酶標儀檢測每孔細胞在490 nm處的吸光度值A(chǔ)。將黃連素的最佳抑制濃度用于后續(xù)實驗。實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況取HCT-116細胞，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，將加入150 μmol/L（最佳抑制濃度）黃連素的細胞作為治療組，未加入黃連素的細胞作為對照組，每組均設(shè)置3個復孔，常規(guī)培養(yǎng)48 h。各組細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，加入PBS洗滌并重懸細胞，依次加入PI和AnnexinV-FITC溶液，室溫避光反應(yīng)25 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.5 miRNA-29b- 3 p過表達和低表達模型的建立將HCT-116細胞以適當濃度接種于6孔細胞培養(yǎng)板上，37℃、5%CO2培養(yǎng)至細胞融合度約為50%，按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書要求的操作步驟，將過表達miRNA-29b-3p的miRNA-29b-3p模擬物（miRNA-29b-3p mimics）、低表達miRNA-29b-3p的抑制物（anti-miRNA-29b-3p）轉(zhuǎn)染至HCT-116細胞，轉(zhuǎn)染24 h后，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，qRT-PCR檢測建模成功后，用于實驗。待 miRNA-NC（miRNA-29b-3P）、miRNA-29b-3p mimics轉(zhuǎn)染至HCT-116細胞后，分別標記為miRNA-NC組、miRNA-29b-3p mimics組，檢測轉(zhuǎn)染48 h后，檢測miRNA-29b-3p過表達對HCT-116細胞存活和凋亡的影響。待anti-miRNA-NC（miRNA-296-3P）、anti-miRNA-29b-3p轉(zhuǎn)染至HCT-116細胞后，采用150 μmol/L的黃連素處理48 h，檢測miRNA-29b-3p低表達對anti-miRNA-NC組、antimiRNA-29b-3p組HCT-116細胞存活和凋亡的影響。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-29b- 3 p相對表達量的比較

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，HCT-116細胞中miRNA-29b-3p的相對表達量為（0.20±0.05），低于Caco-2細胞的（0.32±0.04）和NCM460細胞的（1.01±0.08），差異均有統(tǒng)計學意義（t=3.246、14.871，P＜0.05），因此，選擇結(jié)直腸癌HCT-116細胞進行后續(xù)實驗。150 μmol/L黃連素處理HCT-116細胞48 h后，治療組細胞中miRNA-29b-3p相對表達量為（1.32±0.16），明顯高于對照組細胞的（0.20±0.05），差異有統(tǒng)計學意義（t=11.573，P＜0.01）。

2.2 不同濃度黃連素處理后細胞存活率的比較

MTT檢測結(jié)果顯示，不同濃度黃連素處理24、48 h后，與0 μmol/L黃連素處理的HCT-116細胞的存活率比較，采用 25、50、100、150、200 μmol/L 的黃連素處理的HCT-116細胞的存活率均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而 150 μmol/L 和200 μmol/L的黃連素處理的HCT-116細胞的存活率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。150 μmol/L黃連素處理48 h的HCT-116細胞的存活率低于給藥24 h的存活率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。因此，黃連素為150 μmol/L，處理48 h時，達到最佳抑制濃度。

表1 不同濃度黃連素作用于結(jié)直腸癌HCT-116細胞后細胞存活情況的比較（%，± s）

表1 不同濃度黃連素作用于結(jié)直腸癌HCT-116細胞后細胞存活情況的比較（%，± s）

注：a與0 μmol/L黃連素處理的HCT-116細胞比較，P＜0.05；b與150 μmol/L黃連素處理24 h的HCT-116細胞比較，P＜0.05

黃連素濃度（μ m o l/L）0 2 5 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 1 0 0.1 0±4.4 2 8 6.4 9±4.4 1 a 7 0.2 7±2.2 0 a 5 8.5 6±4.5 9 a 4 4.1 4±2.5 5 a 3 7.8 4±4.4 1 a 1 0 1.1 7±3.8 3 8 4.9 8±5.3 9 a 6 5.7 1±5.9 1 a 5 0.5 3±4.3 0 a 3 4.5 1±2.9 5 a b 3 7.0 3±1.6 7 a給藥2 4 h 給藥4 8 h

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

經(jīng)150 μmol/L黃連素處理HCT-116細胞48 h后，治療組細胞凋亡率為（17.92±2.63）%，明顯高于對照組細胞的凋亡率（8.47±1.09）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.749，P＜0.01）。（圖1）

2.4 miRNA-29b- 3 p過表達對HCT-116細胞存活和凋亡情況的影響

圖1 治療組和對照組HCT-116細胞的凋亡情況

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后miRNA-29b-3p mimics組細胞miRNA-29b-3p的相對表達量為（1.39±0.17），明顯高于miRNA-NC組細胞中miRNA-29b-3p的相對表達量（0.20±0.07），差異有統(tǒng)計學意義（t=11.211，P＜0.01）。轉(zhuǎn)染48 h，未經(jīng)黃連素處理的HCT-116細胞存活和凋亡情況結(jié)果顯示，miRNA-29b-3p mimics組HCT-116細胞存活率為（32.74±3.62）%，明顯低于miRNA-NC組細胞的（98.96±5.21）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=18.079，P＜0.01）；miRNA-29b-3p mimics組HCT-116細胞凋亡率為（19.80±2.31）%，明顯高于miRNA-NC組的（8.23±1.14）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.780，P＜0.01）（圖2）。

圖2 流式細胞儀檢測miRNA-29b- 3 p過表達對HCT-116細胞凋亡的影響

2.5 miRNA-29b- 3 p低表達對HCT-116細胞存活和凋亡情況的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，處理后的anti-miRNA-29b-3p組HCT-116細胞miRNA-29b-3p的相對表達量為（0.04±0.01），低于anti-miRNA-NC組細胞的（0.20±0.06），差異有統(tǒng)計學意義（t=4.556，P＜0.05）。經(jīng)150 μmol/L黃連素處理HCT-116細胞48 h后，細胞存活和凋亡情況結(jié)果顯示，anti-miRNA-29b-3p組HCT-116細胞存活率為（81.06±9.54）%，明顯高于anti-miRNA-NC組細胞的（35.64±3.75）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.675，P＜0.01）；細胞凋亡率為（8.94±0.91）%，明顯低于anti-miRNANC組細胞的（16.54±1.38）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.963，P＜0.01）。（圖3）

3 討論

圖3 流式細胞儀檢測miRNA-29b- 3 p低表達對HCT-116細胞凋亡的影響

黃連素從天然藥用植物中提取，藥理作用廣泛、不良反應(yīng)小，常用于治療消化道疾病，可預(yù)防和治療腫瘤[12]，能夠抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并促進腫瘤細胞凋亡[13]。黃連素可延長食管癌細胞的細胞周期，使多數(shù)腫瘤細胞停滯在G0/G1期，抑制腫瘤細胞的增殖[14]。Park等[15]探討黃連素對胰腺癌細胞增殖的影響，結(jié)果顯示，黃連素能誘導腫瘤細胞停滯于G1期，抑制細胞增殖并誘導其凋亡。Yip和Ho[16]對肝癌的研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可通過上調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）的表達水平，激活caspase 9/caspase 3途徑，誘導腫瘤細胞線粒體凋亡，從而誘導肝癌細胞凋亡，起到抗癌作用。彭洪等[9]研究顯示，黃連素可通過下調(diào)YKL-40-AKT-cyclin D1信號通路影響細胞周期，從而抑制細胞增殖；同時，黃連素還可抑制livin蛋白的表達，從而誘導腫瘤細胞凋亡。本研究采用不同濃度的黃連素分別處理HCT-116細胞 24、48 h，結(jié)果顯示，150 μmol/L的黃連素處理48 h，可有效誘導HCT-116細胞凋亡。

miRNA是一類非編碼小分子RNA，參與細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程，并調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達[17]。其中，miRNA-29b能夠與DNA甲基化酶的3'非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，減弱基因的甲基化水平，使抑癌基因恢復表達[18]。研究表明，miRNA-29b能夠調(diào)控腫瘤相關(guān)基因，抑制腫瘤發(fā)展，發(fā)揮抑癌基因的抑癌作用[19-20]。Steele等[21]研究顯示，miRNA-29b能夠抑制前列腺癌細胞增殖，從而抑制前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。此外，miRNA-29b能直接靶向結(jié)合賴氨酸去甲基化酶2A（lysine demethylase，KDM2A）抑制胃癌細胞的增殖和遷移[22]。miRNA-29b-3p是miRNA-29b的家族成員，能夠抑制膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲[23]，膠質(zhì)母細胞瘤細胞過表達miRNA-29b-3p可促進腫瘤細胞凋亡[24]，表明miRNA-29b-3p在腫瘤中可能起抑制作用。本研究結(jié)果顯示，治療組細胞中miRNA-29b-3p表達水平明顯高于對照組；轉(zhuǎn)染48 h后，miRNA-29b-3p mimics組細胞凋亡率明顯高于miRNA-NC組，表明采用黃連素處理細胞或miRNA-29b-3p過表達能抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡。此外，本研究結(jié)果顯示，150 μmol/L 的黃連素處理 48 h，antimiRNA-29b-3p組細胞存活率高于anti-miRNA-NC組細胞，細胞凋亡率低于anti-miRNA-NC組細胞，表明抑制miRNA-29b-3p的表達可逆轉(zhuǎn)黃連素對HCT-116細胞的抑增殖和促凋亡作用。綜上所述，黃連素和miRNA-29b-3p均能抑制結(jié)直腸癌HCT-116細胞的增殖并誘導其凋亡，抑制miRNA-29b-3p的表達可逆轉(zhuǎn)黃連素對HCT-116細胞的抑增殖和促凋亡作用，但具體的作用機制尚需進一步深入研究。