茶渣蛋白糖基化改性工藝優(yōu)化及功能特性研究

楊 旭 任 珍

(1. 安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000；2. 陜西省富硒食品工程實(shí)驗(yàn)室，陜西 安康 725000)

茶渣是茶葉經(jīng)沖泡飲用或活性成分提取加工后的副產(chǎn)物[1]，含有豐富的纖維素、木質(zhì)素、蛋白、多酚、多糖、皂素等功效成分[2-3]。茶渣中蛋白約15%～30%[4]，且以堿溶性蛋白為主，占蛋白總量的55.06%[5]。研究表明，茶渣蛋白具有高的疏水性，溶解度較差[6]39[7]1-2，因此乳化性、乳化穩(wěn)定性、表面張力和黏度等功能性質(zhì)方面不利于在食品中的應(yīng)用。

為了提升茶渣蛋白的功能特性，目前已報(bào)道的改性方法有限制性酶解法和擠壓膨化法。王洪新等[8]利用酶法水解改性后，茶渣蛋白的溶解性、起泡性、乳化性提高，但泡沫穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性均有所降低。黃夢(mèng)姣等[9]通過(guò)擠壓改性法，使綠茶渣的水溶性提高了7.41%，但擠壓膨化中高溫高壓對(duì)產(chǎn)品的色澤、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等的不良影響，使其他改性方法的探究具有發(fā)展空間。

糖基化改性是利用蛋白質(zhì)—糖的接枝反應(yīng)形成共價(jià)復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的化學(xué)改性。此方法已應(yīng)用于燕麥[10]、米渣[11]、玉米[12]等蛋白的改性，但在茶渣蛋白中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)擬以濕法糖基化對(duì)茶渣蛋白進(jìn)行改性，探究糖基供體種類、反應(yīng)物比例、pH、溫度和時(shí)間對(duì)糖基化效果的影響，并分析改性前后茶渣蛋白的溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性的變化情況。以期為糖基化改性法在茶渣蛋白中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

綠茶：安康市紫陽(yáng)縣向陽(yáng)茶廠；

葡萄糖、葡聚糖、乳糖、麥芽糊精：分析純，北京酷爾化學(xué)科技有限公司；

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，上海江萊生物科技有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

低速離心機(jī)：LD4-2A型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；

恒溫振動(dòng)水浴鍋：SHA-C型，常州國(guó)華電器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：GZX-GF101-2-BS型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ-50N型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理 綠茶原料以料液比1∶110(g/mL)加水于85 ℃下沖泡30 min，重復(fù)2次[13]，抽濾后剩余的茶渣在50 ℃下干燥至恒重，粉碎過(guò)60目篩，備用。

1.2.2 茶渣蛋白的提取 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)所得的優(yōu)化提取工藝，茶渣樣品用0.075 mol/L NaOH溶液以1∶60(g/mL)的料液比在54.2 ℃下水浴振蕩提取4 h，浸提液經(jīng)添加4%雙氧水在50 ℃下脫色，并于pH 3.5下等電點(diǎn)沉淀后，冷凍干燥。

1.2.3 糖基供體的選擇及評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)定

(1) 茶渣蛋白—糖的共價(jià)復(fù)合物制備：參考王成波[14]的方法略作修改。以0.075 mol/L NaOH溶液復(fù)溶茶渣蛋白，使蛋白質(zhì)量濃度為1.2%，取20 mL按1∶1的質(zhì)量比加入不同糖基供體，磁力攪拌20 min使其混合均勻。用0.1 mol/L HCl溶液或0.1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH至11.0，磁力攪拌5 min。將茶渣蛋白—糖混合液置于90 ℃下水浴加熱反應(yīng)一定時(shí)間，并在冰浴中冷卻5 min 以終止反應(yīng)，所得樣品液于4 ℃冷藏待用。

(2) 接枝度測(cè)定：采用鄰苯二甲醛法[15]。

(3) 褐變指數(shù)測(cè)定：參照Sun等[16]的方法，以反應(yīng)體系在420 nm下的吸光度值為褐變指數(shù)。

(4) 溶解性測(cè)定：根據(jù)張蓓等[10]的方法修改如下，將共價(jià)復(fù)合物樣品液冷凍干燥后，配制成1 mg/mL復(fù)合物溶液，9 000 r/min離心15 min，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量，并按式(1)計(jì)算溶解性。

(1)

式中：

SI——溶解性，%；

P1——上清液中蛋白質(zhì)含量，μg/mL；

P0——樣品中總蛋白質(zhì)含量，μg/mL。

(5) 乳化性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定：參照文獻(xiàn)[17]，配制1 mg/mL的共價(jià)復(fù)合物樣品液進(jìn)行測(cè)定。

(6) 起泡性及泡沫穩(wěn)定性測(cè)定：參照文獻(xiàn)[18]，配制1 mg/mL的共價(jià)復(fù)合物樣品液進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 茶渣蛋白—糖共價(jià)復(fù)合物的制備工藝優(yōu)化

(1) 茶渣蛋白與糖的質(zhì)量比對(duì)糖基化效果的影響：將茶渣蛋白與選擇的糖基供體分別按照2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4的質(zhì)量比進(jìn)行混合，在90 ℃、pH 11.0條件下反應(yīng)2 h，其他步驟按1.2.3(1)所述制備共價(jià)復(fù)合物。

(2) 體系pH對(duì)糖基化效果的影響：將茶渣蛋白與選擇的糖基供體按照1∶1的質(zhì)量比進(jìn)行混合，分別調(diào)節(jié)pH至8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，于90 ℃下反應(yīng)2 h，其他步驟按1.2.3(1)所述制備共價(jià)復(fù)合物。

(3) 溫度對(duì)糖基化效果的影響：將茶渣蛋白與選擇的糖基供體按照1∶1的質(zhì)量比進(jìn)行混合，調(diào)節(jié)pH至11.0，分別于60，70，80，90，100 ℃下反應(yīng)2 h，其他步驟按1.2.3(1)所述制備共價(jià)復(fù)合物。

(4) 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以質(zhì)量比、pH和反應(yīng)溫度為自變量，接枝度為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，每次樣品的測(cè)定均重復(fù)3次。采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析(P<0.05即為差異顯著)。其中，響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值表示，采用Design Expert 8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基供體的確定

2.1.1 不同糖基供體的糖基化效果分析 圖1為茶渣蛋白分別與葡萄糖、葡聚糖、乳糖、麥芽糊精在0～4 h反應(yīng)過(guò)程中接枝度的變化曲線。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，接枝度均呈先增加后降低的趨勢(shì)。4種糖基供體中，乳糖的接枝度最高，反應(yīng)1 h即為(35.38±0.79)%，其次為葡萄糖，反應(yīng)2 h后達(dá)到最高接枝度(31.58±0.83)%，而葡聚糖和麥芽糊精在受試時(shí)間內(nèi)的接枝度均未超過(guò)15%。葡萄糖、乳糖含有較多的還原性羰基，更容易與茶渣蛋白發(fā)生接枝反應(yīng)，而葡聚糖、麥芽糊精的相對(duì)分子質(zhì)量較大，支鏈的空間位阻效應(yīng)則限制了反應(yīng)的進(jìn)行[10]。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)不同茶渣蛋白—糖復(fù)合物接枝度的影響

Figure 1 Effect of reaction time on the graft degree of the different tea residue protein-saccharide complexes

茶渣蛋白與葡萄糖、葡聚糖、乳糖、麥芽糊精進(jìn)行糖基化反應(yīng)的時(shí)間對(duì)產(chǎn)物褐變指數(shù)的影響如圖2所示。4種糖基供體產(chǎn)物褐變指數(shù)的變化趨勢(shì)一致，在0～4 h反應(yīng)時(shí)間內(nèi)不斷增大，且表現(xiàn)為：葡萄糖>乳糖>麥芽糊精>葡聚糖。結(jié)果表明，葡萄糖和乳糖與茶渣蛋白的反應(yīng)更為劇烈，能夠較快進(jìn)入美拉德反應(yīng)的高級(jí)階段，從而形成褐變物質(zhì)[19 ]。

2.1.2 不同糖基供體的產(chǎn)物功能特性分析 表1為不同糖基供體與茶渣蛋白形成共價(jià)復(fù)合物的功能特性測(cè)定結(jié)果。從表1中數(shù)據(jù)可知，茶渣蛋白—葡萄糖復(fù)合物的溶解性、乳化性和起泡性明顯高于其他3種糖基供體，而乳化穩(wěn)定性與泡沫穩(wěn)定性則是葡聚糖最高，葡萄糖次之。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)不同茶渣蛋白—糖復(fù)合物褐變 指數(shù)的影響

Figure 2 Effect of reaction time on the browning index of the different tea residue protein-saccharide complexes

表1 不同茶渣蛋白—糖復(fù)合物的功能特性?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

因此，綜合接枝度、褐變指數(shù)、功能特性各項(xiàng)指標(biāo)，最終選擇葡萄糖作為茶渣蛋白糖基化改性的最適糖基供體。

2.2 茶渣蛋白—糖共價(jià)復(fù)合物制備的工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

(1) 茶渣蛋白與糖的質(zhì)量比對(duì)糖基化效果的影響：由圖3可知，開(kāi)始時(shí)，隨著葡萄糖的添加比例增大，反應(yīng)底物間的接觸增多，加速了美拉德反應(yīng)的進(jìn)程，接枝度在茶渣蛋白與糖的質(zhì)量比為1∶1時(shí)達(dá)到最大值，為(31.15±0.51)%。而后此作用效果減弱，加之體系黏度隨葡萄糖的添加比例增大而提高，導(dǎo)致底物間的接觸反而受到限制。褐變指數(shù)卻隨質(zhì)量比的增大而呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，且在質(zhì)量比超過(guò)1∶3時(shí)上升幅度增大，可能與副反應(yīng)(如焦糖化)的發(fā)生有關(guān)[11]。因此，確定茶渣蛋白與葡萄糖的適宜質(zhì)量比為1∶1～1∶3。

圖3 茶渣蛋白與葡萄糖的質(zhì)量比對(duì)糖基化效果的影響

(2) 體系pH對(duì)糖基化效果的影響：由圖4可知，隨著體系pH的不斷增大，接枝度呈先增加后降低的趨勢(shì)，而褐變指數(shù)則持續(xù)上升。當(dāng)pH為11.0時(shí)，接枝度達(dá)到最大值，為(31.86±0.81)%。由于提取得到的茶渣蛋白為堿溶性，pH值的提升促使蛋白質(zhì)的溶解性增加，有利于反應(yīng)的進(jìn)行。隨后，極端pH值使氨基的反應(yīng)性降低，枝度有所下降，但茶渣中的多酚與蛋白質(zhì)等物質(zhì)在堿性、濕熱作用下的氧化反應(yīng)會(huì)加劇褐變程度。因此，確定反應(yīng)體系的適宜pH為10～12。

圖4 體系pH對(duì)糖基化效果的影響

(3) 溫度對(duì)糖基化效果的影響：由圖5可知，接枝度和褐變指數(shù)先隨反應(yīng)溫度的升高而逐漸增加，當(dāng)溫度為80 ℃時(shí)，兩個(gè)指標(biāo)分別達(dá)到(31.88±0.54)%和(1.441±0.017)。此階段反應(yīng)溫度的升高使蛋白質(zhì)受熱展開(kāi)，與葡萄糖的反應(yīng)位點(diǎn)增加，反應(yīng)加快。當(dāng)?shù)鞍追肿由瞎矁r(jià)結(jié)合的糖鏈增長(zhǎng)，位阻效應(yīng)的存在使反應(yīng)受到限制，同時(shí)過(guò)高的溫度也會(huì)使茶渣蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低，但高溫卻促使了焦糖聚合物的形成[20]，使褐變指數(shù)繼續(xù)升高。因此，確定適宜的反應(yīng)溫度為70～90 ℃。

圖5 溫度對(duì)糖基化效果的影響

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，糖基化效果的兩個(gè)衡量指標(biāo)中，褐變指數(shù)是美拉德反應(yīng)高級(jí)階段的重要表征，但褐變程度過(guò)大對(duì)產(chǎn)品的色澤會(huì)造成不利影響；接枝度則反映了共價(jià)復(fù)合物主鏈上葡萄糖的接枝程度，其越大越有利于接枝反應(yīng)[21]。因此，以接枝度為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)，具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

采用Design Expert 8軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到的回歸方程如下：

Y= 31.42-1.12A-1.49B+1.82C+0.11AB-1.08AC-0.30BC-1.34A2-2.06B2-3.49C2。

(2)

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

表3 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

表4 回歸模型的方差分析結(jié)果?

? *表示P<0.05，**表示P<0.01。

圖6為各因素交互作用對(duì)接枝度影響的響應(yīng)面圖。通過(guò)該組圖的曲線走勢(shì)和等高線形狀，可反映出3個(gè)考察因素中任意兩個(gè)因素交互作用的強(qiáng)弱，其中茶渣蛋白與糖的質(zhì)量比、反應(yīng)溫度的交互作用對(duì)接枝度影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。根據(jù)擬合的多元回歸方程，最終計(jì)算得到的最優(yōu)組合為茶渣蛋白與糖的質(zhì)量比1∶1.42、體系pH 10.60、反應(yīng)溫度83.68 ℃，此時(shí)接枝度的理論值達(dá)到32.38%。為確定所得到的優(yōu)化工藝對(duì)茶渣蛋白的改性效果，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。此反應(yīng)條件下，測(cè)得產(chǎn)物的接枝度為(32.89±0.53)%，與理論最佳值基本一致，說(shuō)明此改性方案合理可行。

2.2.3 改性前后茶渣蛋白的功能特性測(cè)定 在優(yōu)化的改性工藝基礎(chǔ)上，制備得到茶渣蛋白—葡萄糖共價(jià)復(fù)合物，分別測(cè)定改性前后蛋白質(zhì)的功能特性，結(jié)果見(jiàn)表5。改性前，茶渣蛋白的溶解性僅為(55.31±1.41)%，與其較高的疏水性氨基酸含量有關(guān)；乳化性和對(duì)乳狀液的穩(wěn)定能力分別為(0.205±0.007)%和(25.16±0.69)%，與夏秀芳等[17]報(bào)道的大豆分離蛋白的乳化性(0.160%)和乳化穩(wěn)定性(25.75%)相當(dāng)；起泡性較差，與其溶解性較差有關(guān)，而維持泡沫的穩(wěn)定能力為(57.45±2.57)%。

經(jīng)過(guò)糖基化改性后，測(cè)定的功能特性均有不同程度的提高。溶解性增加了35.78%，較溶解性增加24%的限制性水解法[7]40-41和7.41%的擠壓改性法[9]，效果更為理想。改性后茶渣蛋白的乳化性是改性前的3.02倍，乳化穩(wěn)定性增加了10.72%，優(yōu)于限制性水解改性后茶渣蛋白乳化性7%的提高和乳化穩(wěn)定性的降低[6]34-35。起泡性增加了29.95%，不及酶法水解改性后起泡性的改善效果(增加79%)，泡沫穩(wěn)定性雖較其他功能特性的提升不明顯，但優(yōu)于酶法水解改性[8]。

圖6 因素交互作用對(duì)接枝度的影響

茶渣蛋白溶解性/%乳化性乳化穩(wěn)定性/%起泡性/%泡沫穩(wěn)定性/%改性前55.31±1.410.205±0.00725.16±0.69117.56±1.9057.45±2.57改性后91.09±1.850.620±0.01135.88±1.14147.51±2.5560.68±1.84

3 結(jié)論

本研究從糖基化反應(yīng)的接枝度、褐變指數(shù)和蛋白功能特性3方面考察，選定葡萄糖為最適的糖基供體。以接枝度為響應(yīng)值，茶渣蛋白與葡萄糖的質(zhì)量比、體系pH和反應(yīng)溫度為因子，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立二次多項(xiàng)回歸模型，確定茶渣蛋白的優(yōu)化改性工藝為茶渣蛋白與葡萄糖的質(zhì)量比1∶1、體系pH 10.60、反應(yīng)溫度83.68 ℃。此改性條件下，茶渣蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性較改性前均有提升，說(shuō)明糖基化改性法可用于茶渣蛋白的功能特性改善。后續(xù)可對(duì)改性茶渣蛋白在具體食品模型中的應(yīng)用進(jìn)行研究，以利于茶渣資源的合理開(kāi)發(fā)。