注射器和酵母菌液在“pH影響過(guò)氧化氫酶活性”實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

張 粒

(浙江省寧波北侖泰河中學(xué) 寧波 315800)

1 引言

“影響酶活性的因素”是浙科版高中生物學(xué)必修1《分子與細(xì)胞》中第一個(gè)探究實(shí)驗(yàn)，是引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行探究性學(xué)習(xí)、發(fā)展科學(xué)思維的好材料。浙科版、蘇教版、人教版在“探究pH對(duì)酶活性影響實(shí)驗(yàn)”的酶種選擇上都采用過(guò)氧化氫酶，浙科版建議以豬肝研磨液作為過(guò)氧化氫酶的來(lái)源，采用排水集氣法測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生氣體的體積定量分析過(guò)氧化氫酶活性。是否能改進(jìn)裝置，使操作更簡(jiǎn)便，同時(shí)可定量且同步測(cè)定不同pH條件下過(guò)氧化氫酶的活性；能否優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，深入探討過(guò)酸或過(guò)堿對(duì)過(guò)氧化氫酶活性有何影響。筆者結(jié)合教學(xué)實(shí)踐，進(jìn)行了如下改進(jìn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與優(yōu)化

2.1 裝置優(yōu)化——兩通注射器 50 mL注射器兩支，通過(guò)兩通管連接，一支注射器加入酶溶液，另一支加入H2O2溶液；將H2O2溶液注射到酶溶液中，反應(yīng)開(kāi)始記錄單位時(shí)間內(nèi)注射器中氣體的變化量作為酶活性的檢測(cè)指標(biāo)。改進(jìn)后的裝置使反應(yīng)發(fā)生和定量測(cè)定在同一個(gè)注射器中進(jìn)行，操作更簡(jiǎn)便，數(shù)據(jù)更易獲得，同時(shí)可以定量控制酶和底物的用量。裝置的氣密性檢測(cè)可通過(guò)一支注射器活塞拔出5 mL，組裝成兩通注射器后浸沒(méi)在水面之下，推動(dòng)活塞將注射器中氣體推入另一支，此過(guò)程若無(wú)氣泡產(chǎn)生，即裝置氣密性良好。

圖1 改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)裝置兩通注射器

2.2 材料優(yōu)化——單細(xì)胞真菌酵母 為解決傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)材料鮮肝勻漿和馬鈴薯勻漿的制備過(guò)程中需要研磨、保存不便的弊端，以及多細(xì)胞生物內(nèi)環(huán)境中pH緩沖對(duì)可能引起的對(duì)實(shí)驗(yàn)變量的干擾，聯(lián)想到酶的發(fā)現(xiàn)史中早期酶的研究是從釀酒酵母開(kāi)始，因此選擇安琪干酵母粉，用蒸餾水配制2%酵母溶液備用(不使用葡萄糖溶液配制是為防止酵母自身呼吸作用產(chǎn)生的CO2影響因變量的檢測(cè))，酵母菌作為單細(xì)胞生物，不存在內(nèi)環(huán)境中pH緩沖對(duì)，可減少對(duì)自變量設(shè)置的干擾；同時(shí)酵母菌中過(guò)氧化氫酶含量和活性都大大超過(guò)鮮肝，效果理想，反應(yīng)迅速。

2.3 pH緩沖液范圍及處理優(yōu)化 H2O2對(duì)酸堿度變化(特別是堿性條件下)相比溫度升高更敏感[1]，隨著pH的增大，H2O2自分解明顯加快，而酸性環(huán)境中H2O2較穩(wěn)定。為此，用Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L檸檬酸)作為母液，并減少堿性pH梯度的設(shè)置，利用筆式酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0五個(gè)梯度，將2%酵母溶液和4% H2O2同時(shí)調(diào)節(jié)至相應(yīng)pH。

2.4 定量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化 將對(duì)應(yīng)pH處理的4%H2O2溶液和2%酵母溶液各4 mL加入到注射器中，搭建好裝置，利用裝置同步向?qū)?yīng)酵母菌溶液中推入H2O2，記錄1 min、2 min、3 min注射器內(nèi)O2變化量，統(tǒng)計(jì)O2平均釋放速率(mL/min)，以實(shí)現(xiàn)pH對(duì)過(guò)氧化氫酶活性影響的探究。

將pH4.0和pH8.0處理的酵母菌溶液恢復(fù)到適宜的pH條件，催化效率會(huì)變化嗎？基于學(xué)生提出的問(wèn)題，利用該裝置設(shè)計(jì)將緩沖液pH4.0和pH8.0處理酵母菌溶液后再恢復(fù)至上個(gè)實(shí)驗(yàn)中酵母過(guò)氧化氫酶活性較高的pH6.0條件，以探究過(guò)酸或過(guò)堿處理對(duì)酶活性的不同影響。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 pH對(duì)酵母菌過(guò)氧化氫酶活性的影響實(shí)驗(yàn) pH對(duì)過(guò)氧化氫酶活性影響明顯(表1)，隨著pH增大，酶活性先增強(qiáng)后減小，pH6.0時(shí)酵母菌中過(guò)氧化氫酶活性較強(qiáng)(圖2)。

3.2 過(guò)酸或過(guò)堿處理對(duì)酵母菌過(guò)氧化氫酶活性的影響 當(dāng)pH4.0和pH8.0處理的酵母菌過(guò)氧化氫酶恢復(fù)至最適pH，催化H2O2分解產(chǎn)生O2的速率(表2)并未明顯提升(圖3)，由此可知過(guò)酸、過(guò)堿使酶不可逆地部分失活。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)也有類似裝置的研究成果發(fā)表，如利用塑料軟泡做反應(yīng)室與注射器相連制作定量測(cè)定裝置[2]，或用注射器吸取過(guò)氧化氫酶，用針頭扎穿試管塞使反應(yīng)在試管中發(fā)生[3]。筆者認(rèn)為其都有一弊端： 反應(yīng)室與集氣室的分離會(huì)導(dǎo)致劇烈反應(yīng)產(chǎn)生的氣泡堵住連接處而引起集氣量的誤差，而本實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)室與集氣室在同一注射器中進(jìn)行，另一注射器由于隔板的固定作用而活塞無(wú)法移位，這樣大大減少集氣誤差。本裝置的適用性和實(shí)用性較廣，在酶實(shí)驗(yàn)中涉及酶的專一性、高效性的探究，甚至包括不同酶濃度和不同底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響均可以使用該裝置，實(shí)現(xiàn)一裝置，多用途。傳統(tǒng)材料的摒棄，取而代之是市售干酵母，排除自身pH緩沖對(duì)的干擾，也更加簡(jiǎn)便，成本低廉，實(shí)驗(yàn)效果和效率都能大幅提升,使“影響酶活性的因素”的探究在一節(jié)課中完成變?yōu)榭赡?；也有教師用固定化技術(shù)固定酵母[4]或用濾紙片固定肝臟研磨液中過(guò)氧化氫酶[5]，同樣也可達(dá)到較理想的效果。在pH緩沖液設(shè)置中避免強(qiáng)堿對(duì)H2O2自分解的影響，選用較低濃度4%H2O2溶液，且pH梯度設(shè)置在較為合理的pH4.0～pH8.0范圍；在教材實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和學(xué)生的質(zhì)疑中優(yōu)化方案，嘗試探究了過(guò)酸、過(guò)堿處理的酶恢復(fù)至最適pH后酶活性的差異，更直觀有效地說(shuō)明過(guò)酸、過(guò)堿使酶失活。

表1 不同pH下酵母菌中過(guò)氧化氫酶催化H2O2產(chǎn)生O2的速率

A. 3 min時(shí)注射器體積

B. 不同pH下過(guò)氧化氫酶的催化反應(yīng)速率

緩沖液調(diào)節(jié)的2%酵母菌溶液(4mL)pH4.0pH4.0恢復(fù)至pH6.0pH6.0pH8.0恢復(fù)至pH6.0pH8.04%H2O2溶液(mL)44444“酶”注射器中O2變化量(mL)1min5610762min10122213143min1617322322O2的釋放速率(mL/min)1min5610762min56116.573min5.35.710.77.77.3O2的釋放速率-平均值(mL/min)5.15.910.67.16.8

A. 3 min時(shí)注射器體積

B. pH恢復(fù)后過(guò)氧化氫酶的催化反應(yīng)速率