單籽鑒定法篩選辣椒黃綠苗胞質(zhì)雄性不育系YBM-A6恢復(fù)系

孫國(guó)勝，孫春青，戴忠良，馬志虎

（江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400）

雜種優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象是生物界的普遍現(xiàn)象，田淑芳[1]經(jīng)2年觀察測(cè)定45個(gè)辣椒雜交組合得出結(jié)論，辣椒雜交1代的產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)是普遍而明顯的，由于辣椒雜交1代具有增產(chǎn)顯著、抗逆抗病性強(qiáng)、整齊度高等優(yōu)點(diǎn)，在辣椒育種過程中居重要地位。

常規(guī)辣椒雜交育種中，采用人工去雄、授粉的技術(shù)生產(chǎn)辣椒雜交種子，不僅生產(chǎn)成本高，而且種子純度難以保障；采用雄性不育兩用系配種雖然省去人工去雄，但是增加了要拔除50%可育株的步驟，增加了制種成本；利用辣椒胞質(zhì)雄性不育系、保持系及恢復(fù)系（CMS）三系配套制種可以完美克服上述困難，省去人工去雄，簡(jiǎn)化良種配置過程，省時(shí)省工，而且能保證雜種1代的純度[2-6]。目前CMS三系配套不能應(yīng)用于大規(guī)模辣椒制種的限制因素是沒有用于胞質(zhì)雄性不育系配套的優(yōu)良恢復(fù)系，所以篩選獲得與之產(chǎn)生最強(qiáng)雜交優(yōu)勢(shì)的優(yōu)良恢復(fù)系是雄性不育系利用的技術(shù)瓶頸和關(guān)鍵[7]。

雄性不育現(xiàn)象在自然界中普遍發(fā)生。辣椒黃綠苗胞質(zhì)雄性不育系YBM-A6是帶形態(tài)標(biāo)記的辣椒雄性不育系，是由辣椒黃綠苗突變體與H97643自交分離世代中的胞質(zhì)雄性不育株98-1A、98-3A不育源雜交、自交、回交等工作中獲得[8]。辣椒黃綠苗胞質(zhì)雄性不育系在辣椒育種過程中，葉色突變可作為標(biāo)記性狀，簡(jiǎn)化良種繁育[9]，也為辣椒遺傳育種提供了優(yōu)良的種質(zhì)資源[10]。

試驗(yàn)采用上述辣椒黃綠苗胞質(zhì)雄性不育系為母本，自由與自交系（全國(guó)各地搜集的210份辣椒（甜椒）自交系資源）進(jìn)行雜交，收獲F1雜交種子，從每個(gè)組合中各隨機(jī)挑選2粒飽滿的種子在當(dāng)年秋季播種于穴盤進(jìn)行優(yōu)良恢復(fù)系篩選，旨在提供1種快速篩選恢復(fù)系的方法及篩選出1批配套的優(yōu)良恢復(fù)系，加速利用帶有葉色標(biāo)記的辣椒進(jìn)行CMS三系配套制種工作。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料YBM-A6為辣椒黃綠苗胞質(zhì)雄性不育系，屬于無花粉雄性不育系，不育株率為100%，不育性穩(wěn)定，雜交親和力極高，極易坐果，其苗期為黃色，成株黃綠色，頂端新生葉為黃色，其他性狀與其野生型相同；辣椒自交系為江蘇鎮(zhèn)江農(nóng)科所自有及從全國(guó)各地搜集的共計(jì)210份辣椒（甜椒）穩(wěn)定材料，編號(hào)CR01—CR210。

1.2 試驗(yàn)方法

雜交試驗(yàn)于2017年春天在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所行香試驗(yàn)基地進(jìn)行。2017年1月16日采用地?zé)峋€加溫育苗；3月5日定植，沿大棚走向起壟，自交系與YBM-A6不育系間隔種植，每個(gè)自交系定植4株，YBM-A6不育系定植2株，株行距均為50 cm（圖1）。4月下旬—5月上中旬進(jìn)行雜交，采用每個(gè)不育株與1個(gè)自交系雜交的方法，標(biāo)記在不育株主稈，并用橡皮圈套花標(biāo)記已雜交花朵，每個(gè)雜交做4～5朵花。自交系進(jìn)行自交留種。F1雜交果實(shí)成熟后，收獲并編號(hào)SR01—SR210。

圖1 雜交試驗(yàn)定植圖

1.2.1 單籽鑒定法

2017年7月25日待所有種子收獲后，從210份雜交組合F1種子中各隨機(jī)選取2粒飽滿的種子，分為A、B兩組，每組1粒，每穴播1粒于72孔穴盤，待出苗后常溫狀態(tài)管理20 d。

為了防止篩選到的恢復(fù)材料中存在溫敏型材料，將A組辣椒苗置于21 ℃光照12 h、17 ℃黑暗12 h條件下的光照培養(yǎng)箱中，B組置于27 ℃光照12 h、21 ℃黑暗12 h條件下的光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20 d后取出正常管理。

待出3朵花后，開始鑒定其育性。鑒定內(nèi)容：a.花是否正常開放；b.是否有花粉及花粉活力（TTC染色法）；c.坐果情況[11]。整個(gè)過程在穴盤中進(jìn)行。調(diào)查完上述項(xiàng)目后，將具有恢復(fù)能力的組合移栽花盆，無恢復(fù)能力的組合拔除。

單籽鑒定法種子于2017年7月25日播種，于10月17日全部調(diào)查結(jié)束。

1.2.2 田間鑒定法

田間鑒定安排在2018年春季，2017年12月27日播種210份F1雜交種，2月28日定植，株距為50 cm，行距為60 cm，每組合定植2株（僅鑒定1株，另外1株作為備用株），210份材料共定植420株，占地180 m2，至2018年5月份辣椒開花坐果后鑒定結(jié)束。鑒定內(nèi)容與單籽鑒定法相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 單籽鑒定結(jié)果

秋季穴盤單籽鑒定結(jié)果表明，2組中均能正常開花，有花粉且通過TTC染色花粉著色好，能正常坐果的可育株均為52個(gè)；部分花具有育性或者2組材料表現(xiàn)不同的（如一組表現(xiàn)可育，另一組表現(xiàn)不可育或者部分可育），其中A組有11個(gè)，B組有13個(gè)；表現(xiàn)為全不育的，A組147個(gè)，B組145個(gè)。2組試驗(yàn)中通過單籽鑒定法篩選出的恢復(fù)系材料均占試驗(yàn)材料的24.8%（表1）。

2.2 大田鑒定結(jié)果

大田鑒定結(jié)果表明，表現(xiàn)為能正常開花，有花粉且通過TTC染色花粉著色好，能正常坐果的可育株為51個(gè)；部分花具有育性的有20個(gè)；表現(xiàn)為全不育的為139個(gè)。具有恢復(fù)能力的材料占總試驗(yàn)材料的24.3%（表2）。

2.3 單籽鑒定與大田鑒定對(duì)比

通過表3可見，2種鑒定方法在用地量和所用時(shí)間上差異很大，單籽鑒定法僅使用8個(gè)72孔穴盤即可將恢復(fù)系篩選出來，用時(shí)約3個(gè)月；而大田鑒定法需要用到約180 m2的簡(jiǎn)易大棚，用時(shí)約1年時(shí)間。而恢復(fù)系篩選占比卻相差不大，2種鑒定方法準(zhǔn)確性一致。

3 結(jié)論與討論

雄性不育恢復(fù)系是能使不育系恢復(fù)正常結(jié)實(shí)的品系（種）。恢復(fù)系雌雄蕊正常，能自交結(jié)實(shí)。雄性不育恢復(fù)系恢復(fù)力的高低和其他性狀的好壞，直接影響著三系在雜種優(yōu)勢(shì)利用上的價(jià)值。在雜交育種中，雄性不育系、雄性不育保持系和雄性不育恢復(fù)系必須配套使用；因此雄性不育恢復(fù)系的篩選具有十分重要的意義，傳統(tǒng)篩選過程一般都在大田中進(jìn)行，容易受到天氣的影響，溫度不受控制，篩選過程較長(zhǎng)。

表1 單籽栽培組合育性調(diào)查結(jié)果

表2 大田組合育性調(diào)查結(jié)果

表3 單籽鑒定和大田鑒定對(duì)比

對(duì)辣椒胞質(zhì)雄性不育系恢復(fù)系的篩選，前人做過較多研究，王恒明等[2，4]、王蘭蘭等[3，5]、劉金兵等[11]對(duì)恢復(fù)系的篩選均采用第1年雜交，第2年春天鑒定的方法，這種鑒定方法大大加大了工作量。本試驗(yàn)在2017年上半年進(jìn)行雜交，下半年采用單籽法鑒定其育性，大大減少了工作量。單籽鑒定法省時(shí)，按此方法進(jìn)行恢復(fù)系篩選與傳統(tǒng)篩選方法相比可節(jié)省時(shí)間200 d左右；省地，試驗(yàn)在穴盤中進(jìn)行，只需少量土地；省費(fèi)用，若種子存在溫敏型雄性不育系情況，大田鑒定則需要春秋兩季進(jìn)行，而單籽鑒定法在光照培養(yǎng)箱中即可進(jìn)行，省掉秋季大田鑒定的費(fèi)用。單籽鑒定法與大田鑒定法2種方法在鑒定結(jié)果上吻合，篩選到的恢復(fù)系占比均超過24%。單籽鑒定法鑒定恢復(fù)系是較為嚴(yán)苛的鑒定方法，其隨機(jī)播種1粒種子，若其為全可育，則認(rèn)為這個(gè)組合里面存在不可育的種子的情況可以忽略不計(jì)；若播種的1粒種子開花后存在無花粉或不可育情況，則認(rèn)為即使其他種子存在可育情況，這個(gè)組合也非100%可育，則不具有利用價(jià)值。

尋找CMS三系配套育種的恢復(fù)系是長(zhǎng)期工作，利用現(xiàn)有或已經(jīng)找到的恢復(fù)系配制的雜交種得不到市場(chǎng)認(rèn)可，需要繼續(xù)尋找具有利用價(jià)值的恢復(fù)系。單籽鑒定法鑒定恢復(fù)系能大量節(jié)省篩選時(shí)間，為致力于研究CMS三系配套的科研人員提供了很大的便利。