一例豬鏈球菌的分離與鑒定

李天芝，于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

豬鏈球菌（Streptococcus suis,SS）是常見的豬病原菌，根據(jù)莢膜抗原的不同可分為35種血清型（1～34型及1/2型），各血清型間交叉保護(hù)力差。其中最常見、公認(rèn)對(duì)豬危害最大型的血清型是1型、2型、1/2型、7型、9型和14型[1]，尤其是2型，流行最廣、致病性最強(qiáng)，可感染牛、羊、豬、雞、鴨、鵝等多種動(dòng)物，也可以感染人，引起人的鏈球菌病，是一種重要的人獸共患性病原菌[2]。由豬鏈球菌引起的疾病稱為豬鏈球菌病，該病在世界范圍廣泛流行，各品種和日齡豬均可發(fā)生，1～3月齡仔豬高發(fā)，臨床表現(xiàn)類型多樣，如敗血型、關(guān)節(jié)炎型、腦膜炎型和淋巴結(jié)膿腫型等[3]。豬鏈球菌病可通過呼吸道、消化道等多種途徑傳播，也可通過破損的皮膚和黏膜傳播。豬鏈球菌病是當(dāng)前危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的一種細(xì)菌性疾病之一。

2018年8月，魯北地區(qū)某豬場(chǎng)斷奶仔豬不明原因死亡，送魯北獸醫(yī)診斷中心診斷，詢問畜主知豬死前倒地，體溫高達(dá)41℃，有四肢劃水神經(jīng)癥狀，觀察死亡豬只，皮膚有大小不一的紫斑；剖檢可見死亡豬血液凝固不良，脾臟腫大、呈暗黑色，肝臟腫大、邊緣鈍圓、質(zhì)脆，全身淋巴結(jié)腫大，腹腔內(nèi)有大量黃色液體，并有纖維蛋白滲出，肺臟腫脹，有出血點(diǎn)，腦膜出血，腦脊液渾濁，關(guān)節(jié)腫大，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有膿性分泌物。筆者無(wú)菌采取病死豬的肝、脾、關(guān)節(jié)液及腦等作為病料，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、PCR鑒定、致病性試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)，確定此分離菌是豬鏈球菌，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病料采集

病死豬剖檢后，無(wú)菌采集肝臟、腦、關(guān)節(jié)液等作為病料。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

15只18～22g清潔級(jí)健康昆明系小鼠購(gòu)自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；4頭30日齡仔豬購(gòu)自濱州周邊豬場(chǎng)。

1.3 試劑

草酸銨結(jié)晶紫、革蘭氏碘液、石炭酸復(fù)紅染液由山東綠都生物科技有限公司質(zhì)量監(jiān)察提供；胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB）購(gòu)自北京中海生物科技有限公司；新生牛血清購(gòu)自天津康源生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片及生化試驗(yàn)用各種試劑及糖發(fā)酵管等均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；Premix Tag、DL 2 000 DNA Marker、細(xì)菌基因組提取試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒和多功能DNA純化回收試劑盒均購(gòu)自北京百泰克生物科技有限公司；pMD18-T載體購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.4 PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank登錄得的豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶（GDH）基因保守序列，設(shè)計(jì)豬鏈球菌檢測(cè)通用引物，引物序列分別為：GDH-F：5'-AAGTTCCTCG GTTTTGAGCA-3'，GDH-R：5'-CGGAGGCGTTTGTA TTGA-3'；擴(kuò)增目的基因片段大小約242 bp，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 細(xì)菌分離、培養(yǎng)

將無(wú)菌采集的豬肝、脾、關(guān)節(jié)液及腦等病料樣品，超凈臺(tái)內(nèi)用火焰燒其表面除菌，剪切新鮮創(chuàng)口，使用冷卻的接種環(huán)蘸取病料，分別劃線接種于麥康凱營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、含4%新生牛血清的TSB固體平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落形態(tài)，挑取可疑菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢。

1.6 生化鑒定

分離的鏈球菌傳代純化后，挑取單菌落接種細(xì)菌生化微量鑒定管，進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)及其它生化試驗(yàn)，37℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。

1.7 藥敏試驗(yàn)

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)分離菌的藥物敏感性，挑取分離菌單菌落致密劃線接種于4%新生牛血清的TSB固體平板，用無(wú)菌鑷子夾取藥敏紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，各紙片距離要相等。紙片與紙片的中心距離不小于24mm，紙片與平皿邊緣不少于15mm，并輕壓使其緊貼平皿表面，平板倒置于37℃溫箱中，培養(yǎng)18 h。觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑大小。

1.8 PCR 鑒定

取培養(yǎng)的分離菌菌液，按基因組DNA試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA作模板，以GDH-F和GDH-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：Premix Tag 10 μL，引物 GDH-F 和 GDH-R 各 1 μL（10 pmol/L），DNA 模板 2 μL，加水補(bǔ)足至 20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 5 min，變性94℃ 20 s，退火52℃20 s，延伸72℃20 s，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物回收后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，將初步鑒定為陽(yáng)性的重組菌送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.9 致病性試驗(yàn)

1.9.1 小白鼠致病性試驗(yàn) 15只小白鼠，分成兩組，試驗(yàn)組10只，分別腹腔接種細(xì)菌分離培養(yǎng)物0.2 mL（4×108CFU/mL），對(duì)照組 5 只，分別腹腔注射0.2 mL TSA液體培養(yǎng)基。注射后小白鼠隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及死亡情況。取死亡小鼠的肝臟、脾進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.9.2 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 30日齡斷奶仔豬4只，平均分成兩組，試驗(yàn)組耳靜脈注射2 mL分離菌（含2×108CFU/mL）液體純培養(yǎng)物。對(duì)照組注射2 mL TSA液體培養(yǎng)基，觀察仔豬發(fā)病及死亡情況。剖檢死亡豬只，取肝臟、腦等分離細(xì)菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果

麥康凱瓊脂平板和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，TSB固體平板培養(yǎng)基表面有光滑、圓形、邊緣整齊、灰白色、半透明的菌落生長(zhǎng)，菌落直徑大小0.3～1.0 mm，挑取單菌落，革蘭氏染色、鏡檢，可見革蘭氏染色為陽(yáng)性球菌，少數(shù)長(zhǎng)鏈，多數(shù)呈3～5個(gè)短鏈或單個(gè)存在。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離菌符合豬鏈球菌的生化特性，提示分離到的確為豬鏈球菌。生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 分離菌的生化反應(yīng)結(jié)果

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2，分離豬鏈球菌對(duì)頭孢噻呋、萬(wàn)古霉素、紅霉素、慶大霉素、克林霉素、克拉霉素高度敏感；對(duì)氟苯尼考中度敏感；對(duì)阿莫西林、環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星、大觀霉素耐藥。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 分離菌對(duì)小鼠的致病性 試驗(yàn)組小白鼠于感染后12 h開始死亡，至48 h全部死亡。剖檢死亡后小白鼠可見肝臟、脾臟腫大，膀胱黏膜充血，腎臟腫大，切面有小出血點(diǎn)，胸腔內(nèi)有積液，用肝臟及心血涂片，革蘭氏染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)有大量單個(gè)、成對(duì)或呈短鏈狀革蘭氏陽(yáng)性球菌。對(duì)照組小白鼠未見異常。

2.4.2 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 攻毒組仔豬在攻毒10 h后均精神沉郁，48 h后其中1頭死亡，另1頭在72 h內(nèi)死亡，觀察死亡豬只胸腹下及四肢皮膚有出血點(diǎn)或出血斑，剖檢可見豬血凝不良，全身淋巴結(jié)腫大、出血，心包有積液，心內(nèi)膜出血；腎脾臟腫大，呈暗紅色，胸腔、腹腔有纖維性炎。肝臟觸片，革蘭氏染色鏡檢可見有大量單個(gè)或呈短鏈狀的革蘭氏陽(yáng)性球菌，對(duì)照組豬只則無(wú)任何臨床癥狀出現(xiàn)。

2.5 PCR 鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小為242 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。結(jié)果見圖1。

圖1 分離菌PCR鑒定

目的基因回收后，連pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α，采用PCR方法篩選陽(yáng)性菌落，同時(shí)將含有插入片段的陽(yáng)性質(zhì)粒送去測(cè)序。將測(cè)得序列與GenBank中的豬鏈球菌進(jìn)行同源性比較，與豬鏈球菌GDH基因同源性為100%。

3 討論

豬鏈球菌在世界上廣泛分布，是豬場(chǎng)常在菌。豬鏈球菌病在豬場(chǎng)發(fā)病率高，可通過呼吸道、消化道及損傷的皮膚和黏膜等多種途徑傳播。當(dāng)豬飼養(yǎng)管理不善時(shí)更易發(fā)病，也容易與其它疾病發(fā)生混合感染或作為其它疾病的繼發(fā)病，已成為困擾養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的常發(fā)病。隨著我國(guó)養(yǎng)殖行業(yè)禁抗呼聲高漲及人們對(duì)食品安全的關(guān)注，筆者認(rèn)為未來(lái)對(duì)待鏈球菌等細(xì)菌性疾病的防控策略應(yīng)逐漸由抗生素防控，轉(zhuǎn)變?yōu)樯锇踩C合防控措施為主、疫苗防控為輔的策略。本研究從一發(fā)病豬場(chǎng)成功分離到一株強(qiáng)致病性的豬鏈球菌，并進(jìn)行初步鑒定，為豬鏈球菌病新型疫苗的研制開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)分離的一株豬鏈球菌在6.5%NaCl肉湯中不生長(zhǎng)，V-P試驗(yàn)陰性，淀粉酶試驗(yàn)陽(yáng)性，能發(fā)酵葡萄糖、果糖、半乳糖、山梨醇、麥芽糖、柳醇、水楊素、蔗糖、海藻糖和乳糖，不能發(fā)酵菊糖、木糖、鼠李糖、甜醇、阿拉伯糖、肌醇、棉子糖和衛(wèi)矛醇，符合豬鏈球菌的生化特征。該菌可使試驗(yàn)組小鼠48 h內(nèi)全部死亡，回歸接種豬后，也能致死豬，表明該分離菌具有很強(qiáng)的致病性。GDH基因是豬鏈球菌35種血清型共有的基因，在細(xì)菌能量代謝過程中發(fā)揮著重要的作用[4]，不同血清型豬鏈球菌GDH基因保守性較強(qiáng)，可作為豬鏈球菌種屬分子診斷的靶基因，本試驗(yàn)根據(jù)豬鏈球菌GDH基因設(shè)計(jì)引物，對(duì)分離菌進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)可見預(yù)期目的條帶，測(cè)序結(jié)果顯示與GenBank登錄的豬鏈球菌類GDH基因的同源性為100%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的豬鏈球菌對(duì)頭孢噻呋、萬(wàn)古霉素、紅霉素、慶大霉素、克林霉素、克拉霉素高度敏感；對(duì)氟苯尼考中度敏感；對(duì)阿莫西林、環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星、大觀霉素耐藥。對(duì)分離的豬鏈球菌不敏感的抗生素為豬場(chǎng)內(nèi)常用抗生素，說明豬場(chǎng)因長(zhǎng)期使用這些抗生素而產(chǎn)生了耐藥性。另外，筆者查閱了不少文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，豬鏈球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果并不統(tǒng)一，這可能跟豬場(chǎng)抗生素濫用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性有關(guān)。下一步打算開展分離菌的血型分型、免疫原性等研究，為更好防控該病選用正確的疫苗及新型疫苗研制奠定基礎(chǔ)。

建議豬場(chǎng)發(fā)生鏈球菌病等細(xì)菌性疾病時(shí)，最好分離細(xì)菌，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選取幾種敏感性抗生素輪換或穿梭用藥，提高藥物治療效果，有針對(duì)性地用藥，避免盲目用藥造成的細(xì)菌耐藥性問題。另外鏈球菌病也常與其它豬病混合感染，臨床診斷時(shí)，一定要分清主要疫病和次要疾病，做到有針對(duì)性地治療，控制豬的原發(fā)性疾病。

任何疾病都要遵循防重于治的原則，豬鏈球菌病也一樣[5]，平時(shí)要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，飼喂優(yōu)質(zhì)飼料，圈舍保持適宜環(huán)境，加強(qiáng)清潔消毒工作，避免豬群打斗，出現(xiàn)外傷，做好豬場(chǎng)生物安全措施。有條件的要接種疫苗防控，選用含多種血清型菌株疫苗，這也是豬場(chǎng)未來(lái)鏈球菌病防控的方向。