黃芪、冬蟲(chóng)夏草對(duì)新生鼠腎積水病腎TGF-β1、IGF-1表達(dá)的影響

趙鵬 馬洪 吳謀東,3 劉紅 楊遠(yuǎn)貴 魯強(qiáng) 董淑荃

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院小兒外科，貴州 遵義 563003；2.貴州航天醫(yī)院泌尿外科，貴州 遵義 563000；3.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

腎盂輸尿管連接部梗阻(UPJO)所致腎積水是小兒泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的先天畸形之一。該病大多需手術(shù)解除梗阻，但新生兒腎積水特別是按胎兒泌尿外科(SFU)分級(jí)的0～Ⅱ級(jí)通常是不需要手術(shù)治療的[1]。黃芪、冬蟲(chóng)夏草等對(duì)糖尿病腎病、腎小球腎炎等慢性腎病有保護(hù)作用[2-3]；因UPJO的腎損害也為一慢性過(guò)程，是否也有保護(hù)效應(yīng)未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型為切入點(diǎn)，應(yīng)用黃芪、冬蟲(chóng)夏草進(jìn)行干預(yù)，以探討黃芪、冬蟲(chóng)夏草對(duì)先天性腎積水病腎損害有否保護(hù)作用，以期為臨床更好地治療該類(lèi)病兒提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 SPF級(jí)成年Wistar雌鼠20只(體質(zhì)量250±50 g)，雄鼠5只(體質(zhì)量260±40 g)，由第三軍醫(yī)大學(xué)提供，許可證號(hào)：SCXK(渝)20120005。交配后所生48h內(nèi)的新生Wistar鼠96只，隨機(jī)分為8組，分別為假手術(shù)對(duì)照組、模型組、黃芪低劑量及高劑量組、冬蟲(chóng)夏草低劑量及高劑量組、聯(lián)合用藥低劑量及高劑量組，各12只。假手術(shù)組術(shù)中顯露左輸尿管后即關(guān)腹，作為對(duì)照組；余7組采用腰大肌壓迫左輸尿管上段，制作左輸尿管不全梗阻的新生鼠腎積水動(dòng)物模型[4]，再隨機(jī)分為模型組及上述各干預(yù)組。對(duì)照組、模型組術(shù)后開(kāi)始以生理鹽水1.0 mL/kg/d皮下注射，干預(yù)各組：黃芪低劑量及高劑量組、冬蟲(chóng)夏草低劑量及高劑量組、聯(lián)合用藥(黃芪+冬蟲(chóng)夏草)低劑量及高劑量組，術(shù)后相應(yīng)以1 mL/kg/d、3 mL/kg/d、0.5 mL/kg/d、2 mL/kg/d、(1 mL/kg/d+0.5 mL/kg/d)、(3 mL/kg/d+2 mL/kg/d)進(jìn)行皮下注射。動(dòng)物在飼養(yǎng)3周處死，游離并切取左側(cè)腎臟，切取大小約0.5×0.4×0.3 cm3的病腎組織，置于4%的中性甲醛固定4～6 h，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋后，做病理學(xué)及免疫組化檢測(cè)；另取約50 mg腎組織，剪碎置于去RNA酶的Eppendorf(EP)管中，加入1 mL RNA-Trizol，-80 ℃保存待檢TGF-β1、IGF-1的基因表達(dá)。同時(shí)收集腎盂尿液、ELISA法檢測(cè)尿TGF-β1、IGF-1水平。

1.1.2 主要試劑 黃芪注射液購(gòu)于黑龍江珍寶島藥業(yè)公司，冬蟲(chóng)夏草購(gòu)于廣東省中藥局，冬蟲(chóng)夏草注射液：精密稱(chēng)取10 g天然蟲(chóng)草，粉碎置250 mL圓底燒瓶中加入50 mL蒸餾水回流煎煮3 h、過(guò)濾，反復(fù)3次，濾液濃縮至15 mL，-38 ℃真空冷凍干燥得提取物，用0.9%NS配制相應(yīng)濃度[5]。RNAiso Plus(Trizol液)、TGF-β1mRNA及IGF-1mRNA引物、Prime ScriptTMRT、SYBR?Premix Ex TaqTMIID購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；兔抗鼠TGF-β1、IGF-1 一抗，山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；鼠TGF-β1、IGF-1酶聯(lián)免疫分析盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病腎組織結(jié)構(gòu)的變化 切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素5 min→水洗→鹽酸酒精分化數(shù)秒→水洗→伊紅液染色30 s →水洗→酒精脫水→二甲苯透明→中性樹(shù)膠封片→光鏡下觀察。

1.2.2 免疫組化檢測(cè)病腎組織TGF-β1、IGF-1的表達(dá) 切片脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，pH=6.0的0.01 M檸檬酸鹽高壓鍋抗原修復(fù)2.5 min，采用PV-6001法檢測(cè)病腎組織內(nèi)TGF-β1、IGF-1的表達(dá)。結(jié)果判定：在光鏡下觀察各組免疫組化切片TGF-β1、IGF-1表達(dá)情況，出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。在400倍視野下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)互不重疊區(qū)域，應(yīng)用Image-ProPlus(Version6.0)圖像分析軟件(IPP6.0)進(jìn)行圖像分析，并測(cè)每一圖像陽(yáng)性細(xì)胞的光密度(OD)，計(jì)算平均值。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)病腎組織TGF-β1mRNA、IGF-1mRNA的表達(dá)變化 QPCR反應(yīng)。TGF-β1的上游引物：5′TGGAGCCTGGACACACAGTA3下游引物：5’CGTAGTAGACGATGGGCAGTG3’擴(kuò)增長(zhǎng)度：82 bp；IGF-1的上游引物：5’TGGCACTCTGCTTGC TCAC3’下游引物：5’GGTCCACACACGAACTGAAG3’擴(kuò)增長(zhǎng)度：140 bp，以管家基因β-actin做內(nèi)參進(jìn)行校正，計(jì)算TGF-β1、IGF-1的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)尿TGF-β1、IGF-1的水平鼠TGF-β1、IGF-1酶聯(lián)免疫試劑盒做ELISA反應(yīng)，用ELX-800型酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活 在新生鼠腎積水動(dòng)物模型制作實(shí)驗(yàn)期間，新生鼠96只中死亡5只，其中麻醉過(guò)深致死1只、術(shù)中死亡2只(包括腎動(dòng)脈斷裂死亡1只)，術(shù)后飼養(yǎng)期間腹腔感染死亡2只；存活91只，存活率94.79%(91/96)。表明符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制作。

2.2 病理學(xué)檢查 大體觀：對(duì)照組雙腎等大、無(wú)積水，腎實(shí)質(zhì)質(zhì)地一致；模型組病腎較健腎大，包膜緊張，顏色蒼白，腎實(shí)質(zhì)菲薄，腎盂擴(kuò)張、積水；干預(yù)各組病腎雖仍較健腎大，但腎盂擴(kuò)張、積水較模型組輕(見(jiàn)圖1)。梗阻近端輸尿管擴(kuò)張、增粗，合并積水。鏡下觀：對(duì)照組雙腎腎小球、腎小管發(fā)育正常；模型組病腎腎小球形態(tài)怪異、失常，腎小囊、腎小管明顯擴(kuò)張，腎間質(zhì)纖維化重，伴不同程度炎癥反應(yīng)；干預(yù)各組的病理改變較模型組輕(圖2)，隨藥物劑量增大、以及聯(lián)合用藥，病腎組織結(jié)構(gòu)的損害逐漸減輕。

注：1A.對(duì)照組；1B.模型組；1C.干預(yù)組。

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左腎組織結(jié)構(gòu)變化

2.3 病腎組織內(nèi)TGF-β1、IGF-1蛋白及基因的表達(dá) 對(duì)照組腎組織TGF-β1低表達(dá)、IGF-1高表達(dá)(圖3A-B)，模型組病腎組織TGF-β1高表達(dá)、IGF-1低表達(dá)，以腎小管胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性(圖3C-D)。干預(yù)各組TGF-β1、IGF-1均有不同程度表達(dá)(圖3E-F)。應(yīng)用Image-ProPlus圖像分析軟件測(cè)量的光密度值及RT-PCR檢測(cè)TGF-β1mRNA、IGF-1mRNA見(jiàn)表1。對(duì)照組腎組織內(nèi)TGF-β1、IGF-1光密度及其mRNA與相應(yīng)模型組、干預(yù)各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但干預(yù)各組病腎損害較模型組明顯減輕；黃芪、冬蟲(chóng)夏草干預(yù)各組的低劑量與高劑量組間比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中聯(lián)合用藥組優(yōu)于單一用藥組。表明黃芪、冬蟲(chóng)夏草可調(diào)控新生鼠病腎組織TGF-β1、IGF-1蛋白及基因的表達(dá)，以減輕或阻止病腎的腎損害。

注：A.對(duì)照組TGF-β1，腎小管上皮細(xì)胞弱陽(yáng)性表達(dá)；B.對(duì)照組IGF-1，腎小管上皮細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；C.模型組TGF-β1，左腎腎小管上皮細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；D.模型組IGF-1，左腎腎小管上皮細(xì)胞弱陽(yáng)性表達(dá)；E.干預(yù)組TGF-β1，左腎腎小管上皮細(xì)胞不同表達(dá)；F.干預(yù)組IGF-1，左腎腎小管上皮細(xì)胞不同表達(dá)。

圖3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎組織內(nèi)TGF-β、IGF-1的表達(dá)

注：模型組、干預(yù)各組與對(duì)照組比較，*P<0.05； 干預(yù)各組的低劑量組與高劑量組間比較，△P<0.05。

2.4 病腎尿TGF-β1、IGF-1的水平 ELISA法檢測(cè)病腎尿TGF-β1、IGF-1水平見(jiàn)表2。對(duì)照組尿TGF-β1水平低、IGF-1水平高，模型組病腎尿TGF-β1水平升高、IGF-1水平降低；干預(yù)各組尿TGF-β1、IGF-1水平介于對(duì)照組與模型組之間。對(duì)照組尿TGF-β1、IGF-1水平與相應(yīng)模型組、干預(yù)各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黃芪、冬蟲(chóng)夏草干預(yù)各組的低劑量與高劑量組間比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 實(shí)驗(yàn)各組病腎腎盂尿內(nèi)TGF-β1、IGF-1水平

注：模型組、干預(yù)各組與對(duì)照組比較，*P<0.05； 干預(yù)各組的低劑量組與高劑量組間比較，△P<0.05。

3 討 論

近年來(lái)，隨著圍生期胎兒B超的廣泛普及應(yīng)用，胎兒腎積水的檢出率逐年增多。胎兒出生后在B超的嚴(yán)密監(jiān)測(cè)下，一些無(wú)癥狀、隱匿性新生兒腎積水，按1988年美國(guó)胎兒泌尿外科學(xué)會(huì)(SFU)對(duì)胎兒腎積水及新生兒腎積水的分級(jí)，其中0～Ⅱ級(jí)通常是不需要手術(shù)治療的，但需嚴(yán)密觀察，一旦病腎的分腎功能GFR(腎小球?yàn)V過(guò)率)降至15%以下，則需要手術(shù)及時(shí)干預(yù)[6]。

中成藥黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益氣健脾、扶正固本以及利水消腫、補(bǔ)中益氣之功效[7]，它對(duì)高血壓腎病、糖尿病腎病等慢性腎臟疾病腎損害方面是有保護(hù)作用的[8]；相關(guān)研究表明中藥冬蟲(chóng)夏草對(duì)慢性腎炎、腎衰竭等腎臟疾病的腎損害也具有保護(hù)作用[9]。為此，本實(shí)驗(yàn)以動(dòng)物模型為切入點(diǎn)，應(yīng)用黃芪、冬蟲(chóng)夏草對(duì)先天性腎積水動(dòng)物模型進(jìn)行皮下注射，以期觀察對(duì)先天性腎積水病腎損害有否保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明，黃芪、冬蟲(chóng)夏草干預(yù)各組的病理改變較模型組輕，且隨藥物劑量增大、以及聯(lián)合用藥，病腎組織結(jié)構(gòu)的損害逐漸減輕。說(shuō)明黃芪、冬蟲(chóng)夏草對(duì)先天性腎積水病腎損害具有一定的保護(hù)效應(yīng)。

TGF-β1是多種細(xì)胞產(chǎn)生的一種致纖維化因子，其可增加細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成、減少ECM的降解，具有抑制細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)纖維化的生物學(xué)作用[10-13]。在慢性腎病如糖尿病腎病中，TGF-β1與其相應(yīng)的受體(TGF-β1R I-Ⅲ)結(jié)合后，通過(guò)Smad蛋白在細(xì)胞核內(nèi)大量轉(zhuǎn)錄、復(fù)制，促進(jìn)ECM大量聚集，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，以及引起腎小管上皮的損傷[14-16]。然而在腎臟中廣泛存在的IGF-1，其合成受生長(zhǎng)激素(GH)、胰島素水平等的調(diào)節(jié)，應(yīng)用IGF-1可減輕腎臟纖維化和腎小管的擴(kuò)張等作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組病腎組織TGF-β1在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)升高、IGF-1表達(dá)降低，這與Seseke F等，馬洪等的結(jié)果一致[18-19]。分析原因可能是新生鼠腎積水病腎組織腎小管上皮細(xì)胞分泌TGF-β1、通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路細(xì)胞膜上TGF-β1受體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)大量轉(zhuǎn)錄、翻譯，致使病腎組織TGF-β1高表達(dá)，從而加速腎間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致病腎損害，致使病腎IGF-1分泌降低，IGF-1 呈低表達(dá)。應(yīng)用黃芪、冬蟲(chóng)夏草對(duì)UPJO新生鼠模型皮下注射后，病腎組織TGF-β1表達(dá)減低、IGF-1表達(dá)升高，腎間質(zhì)纖維化減輕，且高劑量組、聯(lián)合用藥組明顯優(yōu)于低劑量組及單一用藥組。究其原因可能是黃芪、冬蟲(chóng)夏草阻礙TGF-β/Smad信號(hào)通路傳導(dǎo)，下調(diào)病腎組織TGF-β1的表達(dá)，阻止被磷酸化后的TGF-β1R I與Smad結(jié)合，抑制ECM的生成，降解腎臟纖維化的發(fā)生，減輕腎間質(zhì)纖維化。此外，病腎也可能通過(guò)調(diào)節(jié)IGF-1活性的特殊蛋白(IGFBPs)之種類(lèi)和數(shù)量，增強(qiáng)IGF-1啟動(dòng)細(xì)胞傳導(dǎo)通路，激活I(lǐng)GF-1基因的正向表達(dá)，從而對(duì)病腎損害起到一定的保護(hù)作用。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)病腎尿TGF-β1、IGF-1水平表明：干預(yù)各組病腎尿TGF-β1、IGF-1水平介于對(duì)照組與模型組之間，這進(jìn)一步證實(shí)黃芪、冬蟲(chóng)夏草通過(guò)調(diào)控新生鼠病腎組織TGF-β1、IGF-1蛋白及轉(zhuǎn)錄水平的變化，對(duì)病腎尿也產(chǎn)生相似的影響。由此可見(jiàn)，黃芪、冬蟲(chóng)夏草能在一定程度上阻止或降低病腎功能的損害，對(duì)先天性腎積水可能通過(guò)下調(diào)TGF-β1或/和上調(diào)IGF-1的表達(dá)，從而對(duì)UPJO病腎損害產(chǎn)生一定的保護(hù)效應(yīng)。

注：A.對(duì)照組左腎腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，腎小球飽滿(mǎn)、腎小囊無(wú)擴(kuò)張；B.模型組左腎腎小球形態(tài)怪異，腎小囊及腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)纖維化量；C.干預(yù)組左腎小球形態(tài)異常，腎小囊及腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)伴間質(zhì)纖維化輕。

圖2 HE染色(HE×400)