包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)方法相關(guān)問題的探討

李 靜

（山西省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，山西太原 030012）

銅綠假單胞菌原名綠膿桿菌，是一種常見的條件致病菌，分類學(xué)上屬于細(xì)菌界變形菌門γ-變形菌綱、假單胞菌目、假單胞菌科、假單胞菌屬，革蘭氏陰性桿菌。菌體細(xì)長(zhǎng)且長(zhǎng)短不一，有時(shí)呈球桿狀或線狀，成對(duì)或短鏈狀排列。銅綠假單胞菌在自然界分布極為廣泛，是土壤中存在的最常見的細(xì)菌之一，水、空氣、人的皮膚、呼吸道和腸道等都有該菌存在。銅綠假單胞菌為專性需氧菌，生長(zhǎng)溫度范圍25 ℃～42 ℃，該菌在4 ℃不生長(zhǎng)而在42 ℃可以生長(zhǎng)，易在潮濕的環(huán)境下存活，是區(qū)別于其他細(xì)菌的顯著特征之一。銅綠假單胞菌是條件致病菌，即在某種特定條件下才能致病，導(dǎo)致人體腸道疾病、皮膚炎癥和繼發(fā)化膿感染，急性腸道疾病和皮膚炎癥，可引發(fā)角膜炎、肺炎等下呼吸道、嬰兒腹瀉泌尿系統(tǒng)感染。銅綠假單胞菌耐藥性強(qiáng)，對(duì)抵抗力較差的人群危害更大，可引起繼發(fā)感染或混合感染的慢性炎癥，甚至引起諸如腦炎、敗血癥等嚴(yán)重急性感染。

目前，我國(guó)市場(chǎng)上生產(chǎn)銷售的包裝飲用水（除生活飲用水、飲用天然礦泉水外）應(yīng)符合《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》（GB 19298—2014）。標(biāo)準(zhǔn)中銅綠假單胞菌的限值規(guī)定為n=5，c=0，m=0（n 為同一批次產(chǎn)品應(yīng)采集的樣品件數(shù)；c 為最大可允許超出m 值的樣品數(shù)；m 為微生物指標(biāo)可接受水平限量值）。即一個(gè)批次包裝飲用水采集樣品數(shù)量為5 桶，任何一桶水中都不可檢出銅綠假單胞菌，否則就判定為銅綠假單胞菌項(xiàng)目不合格。

包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)采用《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2016）中進(jìn)行測(cè)定，為保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，在實(shí)際操作過程中，應(yīng)根據(jù)水樣污染情況選擇合適的稀釋梯度，并注意濾膜放置、菌落純化、綠膿菌素確認(rèn)試驗(yàn)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品來源于省內(nèi)銷售的桶裝飲用水，共計(jì)293批。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN 瓊脂、金氏B 培養(yǎng)基、乙酰胺液體培養(yǎng)基、綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基、鈉氏試劑、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、氧化酶試劑，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；三氯甲烷、分析純，天津市化學(xué)試劑有限公司；鹽酸，分析純，北京化工廠；甘油，分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 27853）；熒光假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC 21620）。

1.4 儀器設(shè)備

SSM-6 多聯(lián)過濾器，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；0.45 μm 微孔濾膜，上海興亞凈化材料廠；BSC-1300IIA2 生物安全柜，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BPC-500F 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；EA-160IFE 紫外燈。

2 檢驗(yàn)方法

采用GB 8538—2016 中濾膜法測(cè)定桶裝飲用水中銅綠假單胞菌，在100 級(jí)的潔凈工作臺(tái)進(jìn)行過濾操作，使用孔徑0.45 μm 濾膜過濾250 mL 水樣或稀釋液，將濾膜移至CN 瓊脂培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)48 h 后觀察CN 平板上菌落形態(tài)，并進(jìn)一步驗(yàn)證可疑菌落。

在CN 瓊脂平板上可能生長(zhǎng)的菌落形態(tài)有：藍(lán)/綠色菌落、產(chǎn)熒光非藍(lán)綠色菌落、紅褐色菌落、其他顏色菌落。不同顏色形態(tài)菌落要進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證（見表1）。CN 瓊脂平板上不同菌落形態(tài)，進(jìn)行相應(yīng)試驗(yàn)驗(yàn)證后確定可疑菌落是否為銅綠假單胞菌，確定后計(jì)數(shù)并得出結(jié)論。

表1 銅綠假單胞菌在CN 瓊脂平板上菌落形態(tài)的選擇與判定

3 結(jié)果

共計(jì)檢驗(yàn)桶裝飲用水293 批次，其中檢出銅綠假單胞菌的有27 批次，檢出率為9.22%。檢測(cè)結(jié)果表明桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢出率相對(duì)較高。

4 討論

為保證包裝飲用水中銅綠假單胞菌不出現(xiàn)漏檢和假陰性結(jié)果，總結(jié)得出在檢驗(yàn)過程中需要注意以下幾點(diǎn)，以降低漏檢和假陰性的可能性。

4.1 過濾水樣

考慮到水樣受污染程度未知且不一致，可以按照GB 4789.2 中樣品稀釋的要求，按照原液（必選）、1∶10、1∶100、1∶1000 的遞增稀釋比例，選擇2～3 個(gè)連續(xù)的稀釋度，然后再進(jìn)行過濾，這樣如果水樣受污染程度嚴(yán)重，將樣品稀釋后過濾，保證濾膜上生長(zhǎng)的菌落數(shù)量在適宜范圍內(nèi)，從而更好地計(jì)數(shù)和挑取單個(gè)菌落做驗(yàn)證試驗(yàn)，計(jì)數(shù)時(shí)按照GB 4789.2 中7.1 的計(jì)算方法來進(jìn)行。

4.2 濾膜的放置

放置濾膜時(shí)，應(yīng)該與培養(yǎng)基表面緊密貼合住，不能產(chǎn)生空隙，因?yàn)楫a(chǎn)生空隙的地方會(huì)造成菌落缺乏營(yíng)養(yǎng)而限制其生長(zhǎng)，最終影響銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致計(jì)數(shù)不夠準(zhǔn)確。

4.3 純化可疑菌落

如果濾膜上生長(zhǎng)的菌落過多影響計(jì)數(shù)，需進(jìn)行多次分離純化（可使用CN 平板或營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板），直至出現(xiàn)多個(gè)單菌落以利于挑取單菌落進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

4.4 綠膿菌素試驗(yàn)

飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法GB 8538 修訂后，微生物檢驗(yàn)項(xiàng)目主要變化是銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)增加了綠膿菌素驗(yàn)證試驗(yàn)。要求CN 瓊脂平板上長(zhǎng)出藍(lán)/綠色菌落不能直接判定為銅綠假單胞菌陽(yáng)性（2008 版檢驗(yàn)方法無此項(xiàng)要求），而是需要經(jīng)過綠膿菌素試驗(yàn)驗(yàn)證才能最終判定為陽(yáng)性。在進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)時(shí)，必須挑取CN 平板上新鮮的（生長(zhǎng)24 h～48 h）不同類型的單菌落各2～3 個(gè)進(jìn)行培養(yǎng)，其次要注意用三氯甲烷浸泡溶解的時(shí)間問題，必須待三氯甲烷提取液由無色變?yōu)樗{(lán)色后，方可將其移至另一試管中滴加1 moL/L 鹽酸，振蕩后靜置，最后判定結(jié)果。