FZD5 在山羊妊娠早期的表達(dá)及激素調(diào)控

邢園園，張 云，崔云鳳，任 杰，倪 華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

胚胎著床是妊娠建立的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是影響繁殖效率的重要因素之一。尤其是體外操作的胚胎，著床率明顯低于體內(nèi)正常發(fā)育的胚胎[1]，是胚胎工程技術(shù)的瓶頸之一。山羊是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，關(guān)于山羊胚胎著床的機(jī)制研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。已有研究表明，Wnt-FZD（Wingless/Int1-Frizzled）信號(hào)通路在多種動(dòng)物的胚胎著床過程中具有重要功能，如調(diào)控子宮內(nèi)膜層重建、子宮接受態(tài)的建立和胚胎黏附等過程[2]。FZD 蛋白家族共分為10 類（FZD1-10），結(jié)構(gòu)均為7 次跨膜受體。當(dāng)Wnt 配體與FZD 受體結(jié)合，可以啟動(dòng)經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、黏附和運(yùn)動(dòng)等功能[3]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)FZD5 參與多種癌癥的發(fā)生，F(xiàn)ZD5 基因沉默后可減少前列腺癌細(xì)胞PC3的遷移和增殖[4]。Peterson等[5]研究表明，F(xiàn)ZD5 受體與SFRP2（Secreted frizzled-related protein 2）結(jié)合激活Wnt/Ca2+通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/NFATC3 通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。Lu 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZD5 基因敲除的小鼠妊娠第10.5 天胎盤血管生成減少，胚胎死亡。但FZD5 在反芻動(dòng)物山羊圍著床期子宮中的表達(dá)與作用尚不清楚。本研究檢測FZD5 基因在山羊圍著床期子宮中的表達(dá)情況，為后續(xù)研究Wnt-FZD 信號(hào)系統(tǒng)在反芻動(dòng)物胚胎著床機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為改進(jìn)胚胎移植、克隆動(dòng)物等胚胎工程技術(shù)操作提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)選擇健康無疾病的未孕母羊27 只（黑龍江本地品種山羊）于黑龍江大慶銀浪羊場統(tǒng)一飼養(yǎng)。山羊的發(fā)情周期一般為17～25 d，平均為21 d，發(fā)情持續(xù)1～3 d。采用公羊試情法鑒定母羊是否發(fā)情，選取穩(wěn)定發(fā)情的用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

1.2.1 發(fā)情周期模型 采用公羊試情法判定山羊發(fā)情后，觀察記錄2 個(gè)發(fā)情周期。選取發(fā)情規(guī)律的山羊，在第3 次發(fā)情當(dāng)天，記為發(fā)情第0 天（ED0）。山羊發(fā)情期ED0、ED6、ED12、ED16 宰殺后30 min 之內(nèi)取出子宮，用PBS 清洗子宮表面存在的污物血跡，健康子宮組織，一部分液氮凍存，一部分固定石蠟包埋。每個(gè)時(shí)期取3只羊。

1.2.2 早期妊娠模型 選擇發(fā)情規(guī)律的母山羊與公山羊配種，通過記錄的交配日期和監(jiān)控是否返情確定妊娠階段。如果沒有返情，則將最后1 次交配日期記錄為妊娠第0 天（D0），根據(jù)日期確定妊娠所處階段。分別于妊娠D0、D6、D16、D19、D25 處死動(dòng)物，取子宮組織。將子宮體分成小塊（每小塊上有明顯肉阜區(qū)）放于液氮中保存，每個(gè)時(shí)期取3 只羊。

1.2.3 類固醇激素處理模型 將健康母山羊的兩側(cè)卵巢切除，恢復(fù)2 個(gè)月康復(fù)后，分為 4 組進(jìn)行皮下注射類固醇激素，每組 3 只。油處理組（對(duì)照）：1 mL 芝麻油/只；雌激素處理組：50 μg/（mL·只）；孕酮處理組：500 mg/（mL·只）；雌激素和孕酮共同處理組：500 mg 孕酮+50 μg 雌激素/（mL·只）。飼養(yǎng) 24 h 之后處死，取材方法同上。

1.3 熒光定量PCR

1.3.1 總RNA 提取及cDNA 合成 按照TRIzol?Reagent試劑說明書提取山羊子宮中總RNA，Nano Drop 2000測RNA 濃度及純度；將得到總RNA 進(jìn)行消化后Nano Drop 2000 測RNA 濃度及純度；按照PrimeScriptTM RT Reagent Kit 試劑盒說明書操作采用兩步法合成第一鏈cDNA 并于-20℃冰箱保存。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)合成 按照Real-time PCR 引物原則，根據(jù)NCBI 提供的基因序列，用Premier 5 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)山羊FZD5 及內(nèi)參GAPDH 引物序列。

表1 引物序列

1.3.3 熒光定量PCR 使用SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）對(duì)妊娠D6（孕體黏附起始）、D16（孕體黏附與延長）、D19（黏附穩(wěn)固）的山羊子宮基因的表達(dá)情況進(jìn)行熒光定量PCR。用ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測。反應(yīng)體系為25 μL：上下游引物（10 mol/L）各1 μL，SYBR?Premix Ex Taq（2×）12.5 μL，ROX 0.5 μL，cDNA 1 μL，Nuclease-free H2O 9 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s（采集信號(hào)），40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)cDNA 樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。由計(jì)算機(jī)根據(jù)擴(kuò)增曲線自動(dòng)分析得出Ct 值，以18S 為內(nèi)參。以公式2-ΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。利用GraphPad Prism 5 軟件統(tǒng)計(jì)組間差異并做圖。

1.4 Western blot 收集子宮組織，加入冰預(yù)冷的蛋白裂解液，用勻漿器勻漿，冰上孵育30 min 后離心取上清液進(jìn)行蛋白定量。50 μg 蛋白沸水中煮5 min，上樣，SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。轉(zhuǎn)移后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。之后與Frizzled-5兔源抗體（1∶500，bs-2930R，Bioss）4℃孵育過夜。PBST 液漂洗，再加入Mouse Anti-rabbit IgG/HRP（1∶2 000，bs-0295M，Bioss）37℃孵育1 h。PBST 洗3 次后，ECL試劑盒顯影。

1.5 免疫組化 子宮組織經(jīng)中性福爾馬林固定液固定，然后脫水和包埋，制成石蠟切片（5 μm），二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后，抗原修復(fù)，加3%H2O2室溫孵育以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS 洗滌后加封閉液（10%馬血清）37℃封閉1 h，滴加Frizzled-5 兔源抗體（1∶50），4℃孵育過夜，PBS 洗滌后滴加Mouse Anti-rabbit IgG/HRP（1∶100）于37℃孵育1 h，PBS 洗滌后加DAB 顯色、終止、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢照相。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)熒光定量所得到的Ct 值，采用2-ΔCt方法進(jìn)行結(jié)果處理。Western blot 結(jié)果使用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件掃描測定，重復(fù)3 次，其中FZD5 灰度值為FZD5 IOD 值與GAPDH IOD 值的比值。免疫組織化學(xué)切片用生物顯微鏡觀察并拍照。數(shù)據(jù)采用SPSS1 9.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 FZD5 mRNA 在妊娠山羊圍著床期子宮中的表達(dá)圖1 顯示，F(xiàn)ZD5 mRNA 在妊娠D6 時(shí)表達(dá)最高，隨著黏附進(jìn)行，D16、D19 顯著低于D6 且表達(dá)規(guī)律呈下降趨勢。

圖1 FZD5 mRNA 在圍著床期子宮中的表達(dá)

2.2 FZD5 蛋白在山羊子宮中的表達(dá)

2.2.1 FZD5 蛋白在山羊早期妊娠子宮中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果（圖2）顯示，在山羊妊娠D6，F(xiàn)ZD5 蛋白表達(dá)于子宮腔上皮、腺上皮中；在妊娠D16，F(xiàn)ZD5 蛋白在子宮腔上皮和腺上皮中同樣檢測到信號(hào)且表達(dá)低于D6；在妊娠D19，F(xiàn)ZD5 蛋白表達(dá)較低。

圖2 圍著床期山羊子宮組織中FZD5 蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（200×）

圖3 FZD5 蛋白的Western blot 檢測結(jié)果

Western blot 結(jié)果顯示（圖3-A），山羊妊娠（D6、D16、D19 和D25）子宮中均檢測到FZD5 蛋白表達(dá)。在妊娠D6、D16 時(shí)FZD5 表達(dá)均高于D19 和D25（P＜0.05），D6、D16 之間差異不顯著，D19 和D25 之間差異不顯著。表明FZD5 在妊娠早期（D6、D16）表達(dá)高于胚胎黏附完成（D19）和胎盤發(fā)生的早期（D25），推測FZD5 蛋白參與山羊孕體著床過程。

2.2.2 FZD5 蛋白在山羊發(fā)情周期子宮中的表達(dá) 如圖3-B所示，在山羊發(fā)情周期（ED0、ED6、ED12 和ED16）的子宮中均有FZD5 蛋白表達(dá)，但表達(dá)無顯著差異。

2.3 FZD5 蛋白在類固醇激素處理子宮中的表達(dá) 如圖3-C 所示，與Oil 處理組相比較，孕酮處理組FZD5 蛋白表達(dá)降低極顯著（P＜0.01）；雌激素處理組FZD5蛋白表達(dá)下降但并不顯著；雌激素和孕酮共同處理組FZD5 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。這一結(jié)果表明，孕酮抑制FZD5 蛋白的表達(dá)，雌激素對(duì)抑制FZD5 蛋白的表達(dá)不顯著。

3 討 論

胚胎著床的方式分為侵入型和非侵入型著床，山羊?qū)儆诜乔秩胧街?，與小鼠相比，山羊子宮內(nèi)膜不進(jìn)行蛻膜化且孕體與子宮腔上皮黏附，同時(shí)還伴隨著孕體在子宮腔內(nèi)的延長，使山羊整個(gè)黏附過程持續(xù)時(shí)間較長，所以山羊是研究胚胎黏附的良好模型。在山羊早期妊娠中，第6 天囊胚進(jìn)入子宮腔并從透明帶中孵出，隨后孕體在子宮腔內(nèi)開始延長；妊娠第14 天時(shí)，孕體開始分泌妊娠識(shí)別信號(hào)干擾素-tau（interferon-tau，IFNT），IFNT 能夠阻礙黃體溶解，繼續(xù)產(chǎn)生孕酮[7-8]。在孕酮作用下孕體延長并與子宮肉阜的上皮細(xì)胞粘附；妊娠第16～17 天，胚胎粘附廣泛發(fā)生，IFNT 分泌達(dá)到峰值，在第20 天分泌水平降低；第19 天孕體與子宮肉阜處子宮內(nèi)膜建立穩(wěn)固黏附；隨著妊娠進(jìn)行，在孕體和子宮肉阜粘附處，組織增生血管發(fā)生，逐漸形成子葉狀胎盤[9]。

在胚胎著床過程中，Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過直接開啟和關(guān)閉大量的基因，如C-MYC、CYCLIN-D1、HOX A-10/11、環(huán)氧合酶-2（COX-2）基因等，以及與其他信號(hào)通路共同作用調(diào)節(jié)胚胎著床過程和胚胎發(fā)育[10]。Sonderegger 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，重組配體Wnt3a 處理人滋養(yǎng)層細(xì)胞可激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，引起基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）分泌，有助于促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞在子宮內(nèi)膜的遷移和侵襲；Carmon 等[12]研究顯示，在人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，高水平FZD5 與Wnt7a 結(jié)合顯示激活β-catenin 經(jīng)典Wnt 信號(hào)并增加上皮細(xì)胞增殖。有研究表明，F(xiàn)ZD5 是分泌的卷曲相關(guān)蛋白（Secreted Frizzled-related Proteins，SFRPs）的受體，并通過內(nèi)皮細(xì)胞中的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/ NFATc3 途徑介導(dǎo)SFRP2誘導(dǎo)的血管生成[13]。本研究結(jié)果顯示，山羊孕體黏附之前，F(xiàn)ZD5 表達(dá)較高，提示FZD5 可能參與子宮腔上皮的增殖。胚胎伸展黏附期結(jié)束后，在妊娠第25 天，F(xiàn)ZD5 表達(dá)上升，可能參與后續(xù)的血管發(fā)生胎盤形成過程。已有研究表明，在小鼠中胚胎著床“窗口”期子宮內(nèi)膜β-catenin 蛋白表達(dá)暫時(shí)性下調(diào)或缺失，有利于促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分化來同步植入前胚胎的發(fā)育[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在山羊胚胎黏附期，Wnt 受體FZD5 的表達(dá)也下調(diào)，F(xiàn)ZD5 可能參與孕體與山羊子宮腔上皮的黏附過程。

孕酮能夠激活和維持子宮內(nèi)膜功能，是孕體生長、植入、胎盤形成以及后期發(fā)育所必需。反芻動(dòng)物妊娠早期孕體分泌IFNT 阻礙黃體退化，使母體處于較高的孕酮水平。肉牛、奶牛和綿羊排卵后高濃度孕酮水平能夠增加孕體長度；在牛的妊娠周期子宮中孕酮誘導(dǎo)子宮內(nèi)環(huán)境改變，支持囊胚生長成卵形狀和延伸成纖維狀孕體[15-16]。孕酮通過影響子宮內(nèi)膜作用于胚胎生長和孕體延長，孕酮誘導(dǎo)子宮上皮細(xì)胞分泌增殖因子（GRP）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SLC5A11）、分泌型黏附蛋白（SPP1），鈣/磷酸鹽穩(wěn)態(tài)的候選調(diào)節(jié)劑（STC1）和免疫調(diào)節(jié)因子等。這些基因進(jìn)一步受到胚胎來源的IFNT 和皮質(zhì)醇的刺激，導(dǎo)致妊娠期子宮腔液成分改變，進(jìn)而影響滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和遷移，調(diào)節(jié)胎體伸長[17-18]。本實(shí)驗(yàn)中，孕酮處理導(dǎo)致山羊子宮中FZD5 蛋白表達(dá)極顯著降低，孕酮可以通過調(diào)控FZD5 影響Wnt 信號(hào)通路影響妊娠的相關(guān)分子事件。

4 結(jié) 論

FZD5 蛋白定位于山羊子宮腔上皮和腺上皮中；在山羊妊娠早期過程中，胚胎黏附之前FZD5 mRNA 和蛋白表達(dá)水平較高，黏附期表達(dá)水平逐漸下降。在山羊發(fā)情周期中FZD5 蛋白表達(dá)無明顯差異；孕酮下調(diào)山羊子宮中FZD5 蛋白表達(dá)。FZD5 在山羊早期妊娠子宮中的表達(dá)具有胚胎著床特異性，胚胎黏附期FZD5 下調(diào)有利于山羊黏附過程，且FZD5 蛋白表達(dá)受孕酮影響下調(diào)。本研究為山羊著床機(jī)制提供研究實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為提高反芻動(dòng)物的繁殖力，為提高胚胎工程操作技術(shù)的效率提供研究思路。