藏藥波棱瓜花水溶性多糖提取工藝實驗研究

劉 芮，唐 棣，劉 群

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省獸藥監(jiān)察所，四川 成都 610041)

波棱瓜花，藏文音譯“色吉美朵”，為葫蘆科植物波棱瓜(Herpetospermum pedunculosum(Ser.) Baill)的干燥花，中文藥名Bolengguahua，拉丁藥名Herpetosper-mi Pedunculosi Flos. 主要產(chǎn)于四川、云南、西藏等省區(qū).根據(jù)古籍文獻(xiàn)記載，波棱瓜花具有清熱解毒，除腑膽熱等功效，藏醫(yī)用于治療赤巴病、肝膽病等疾病[1].關(guān)于波棱瓜花的研究報道目前很少，僅限于波棱瓜的資源考查、性狀研究[2]及非藥用部位波棱瓜籽的化學(xué)成分，如脂肪酸、氨基酸、微量元素(譜)、木脂素等含量研究[3～10]，對入藥部位花的研究僅見張雨欣等對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定研究(水分、浸出物、總灰分、酸不溶性灰分等)[1]，波棱瓜花的化學(xué)成分、藥效學(xué)、藥動學(xué)研究還未見報道.植物多糖為多組分混合物(通常由葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、己糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等組成)，具有不溶于冷水、在熱水中呈粘液狀、遇乙醇能沉淀的理化特點. 本研究采用水煎醇沉法提取波棱瓜花多糖，以影響多糖提取效率的三個因素(料液比、提取溫度、提取時間)為自變量，以提取液多糖含量為響應(yīng)值，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用中心組合設(shè)計響應(yīng)面實驗，優(yōu)化波棱瓜花水溶性多糖提取工藝，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下.

1 材料

1.1 實驗藥材

波棱瓜(Herpetospermum pedunculosum (Ser.).Baill)的干燥花(Herpetospermi Pedunculosi Flos).采集于四川甘孜色達(dá)地區(qū)，室溫通風(fēng)干燥，避光保存；由西南大學(xué)園藝園林學(xué)院李先源教授鑒定.

1.2 儀器設(shè)備

紫外－ 可見分光光度計(Shimadzu Corporation，UV－2007 型)；

電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，HWS24 型)；

電子天平(上海力能電子儀器公司，YB12002 －E)；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司，DHG－9023A 型)；

數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司，HH－2)等.

1.3 試劑

乙醚、苯酚、三氯乙酸、30%過氧化氫等(成都金山化學(xué)試劑有限公司，AR)；無水乙醇(成都市科隆化學(xué)有限公司，AR)；活性碳粉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，AR)等.

2 方法

2.1 工藝流程

干燥—粉碎—脫脂—水提工藝(料液比、提取溫度、提取時間)—脫蛋白—脫色—醇沉—沉淀干燥—多糖.

2.2 波棱瓜花預(yù)處理

波棱瓜花干燥至恒重(50 ℃)，粉碎，24 目過篩.粉末運用索氏提取法，加入夠兩次虹吸量的乙醚，加熱回流6 h，完成脫脂，4 ℃冰箱保存[11－12].

2.3 水提工藝(單因素試驗)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚－濃硫酸結(jié)合紫外分光光度法(490 nm 波長)測定吸光度，利用最小二乘法對吸光度做線性回歸，以獲回歸曲線及回歸方程(Y ＝aX ＋b，R2≈1，表明在一定范圍內(nèi)吸光度X 與多糖質(zhì)量濃度Y 之間的線性關(guān)系良好)[13].

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品紫外－可見光譜圖

樣品:取脫脂藥材粉末1.0 g，蒸餾水10.0 mL，沸水浴2 h，過濾，參照2.3.1“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作”.

紫外－可見光譜圖:將反應(yīng)完全的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液倒入10 mL 比色皿中，以空白對照為參比，200 ～800 nm 波段下進行紫外－可見光掃描，獲標(biāo)準(zhǔn)品和樣品紫外－可見光譜圖[14].

2.3.3 單因素試驗

根據(jù)預(yù)試驗，確定以下為影響多糖提取的主要因素.

單因素試驗操作步驟:

(1)料液比:將7 份脫脂藥材粉末1.0 g 分別加入貼好標(biāo)簽的離心管中，固定提取溫度60 ℃、提取時間4 h，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 條件下進行水提；

(2)提取溫度:根據(jù)最佳料液比，固定提取時間4 h，提取溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃的條件下水提；

(3)提取時間:根據(jù)最佳料液比和提取溫度，提取時間為0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h的條件下水提.

水溶性多糖含量測定方法(苯酚－濃硫酸比色法)操作步驟[15]:在不同料液比、不同提取溫度和不同提取時間的條件下，紗布過濾，獲水溶性多糖提取液(生藥1 g)；取水溶性多糖提取液1 mL，稀釋30倍，苯酚－ 硫酸法測多糖:取稀釋后的水溶性多糖2 mL，加入到標(biāo)記好的玻璃試管中，再加入1 mL5%苯酚溶液和5 mL 濃硫酸；紫外分光光度計(490 nm波長)測定吸光值；水溶性多糖含量計算[12，16～18].

2.4 工藝優(yōu)化(響應(yīng)面分析)

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇料液比、提取溫度、提取時間作為可變影響3 因素，以波棱瓜花水溶性多糖的提取含量為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面試驗，考查料液比、提取溫度、提取時間的一次項、二次項和交互項對波棱瓜花水溶性多糖提取的影響.

2.5 水提工藝重復(fù)性檢測

精確稱取5 份脫脂藥材粉末1.0 g，按照優(yōu)化后的提取工藝，平行制備五份樣品溶液，檢測提取液中波棱瓜花水溶性多糖含量并計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD).結(jié)果可用于評價或驗證水提工藝的隨機誤差.

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液在490 nm 處測得溶液的吸光度(A)見表1.

表1 標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度Table 1 Absorbance of standard solution

回歸方程:繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度，縱坐標(biāo)為吸光度(A)，進行回歸分析，建立回歸方程(見圖1).

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve

表1、圖1 表明:回歸方程為A ＝0. 0098C ＋0.0041，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9974，即葡萄糖質(zhì)量濃度在10～70 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好. 按照方程A ＝0.0098C ＋0.0041 分別計算出上述各個樣品中的水溶性糖濃度，進而換算出多糖提取率，結(jié)果如下:

多糖提取率(%) ＝(水溶性多糖吸光度＋0.0041)/0.0981× 定容總體積(30 mL) ×10－3/干燥波棱瓜花質(zhì)量(1 g) ×料液比×100%.

3.2 單因素實驗

3.2.1 料液比對波棱瓜花水溶性多糖提取率的影響

固定提取溫度60 ℃、提取時間4 h，不同料液比對水溶性多糖提取率影響的結(jié)果見表2、圖2.

表2、圖2 表明:水溶性多糖提取率隨料液比的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.料液比為1∶30 時，提取率最高，因此選擇1∶25、1∶30、1∶35 作為中心組合實驗料液比的三個水平參數(shù).

表2 料液比對水溶性多糖提取率的影響Table 2 Effect of solid－liquid ratio on extraction yield of water－soluble polysaccharide

圖2 料液比對水溶性多糖提取率的影響Fig.2 Effect of solid－liquid ratio on extraction yield of water－soluble polysaccharide

3.2.2 提取溫度對波棱瓜花水溶性多糖提取率的影響

根據(jù)3.2.1 提供的最佳料液比(1∶30)，固定提取時間4 h，不同提取溫度對水溶性多糖提取率影響的結(jié)果見表3、圖3.

表3 提取溫度對水溶性多糖提取率的影響Table 3 Effect of temperature on the extraction yield of water－soluble polysaccharide

圖3 提取溫度對水溶性多糖提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on the extraction yield of water－soluble polysaccharide

表3、圖3 表明:提取溫度在40 ℃～70 ℃，水溶性多糖提取率隨溫度升高而升高，在70 ℃時達(dá)到最高；提取溫度超過70 ℃時，水溶性多糖提取率隨著溫度的升高而呈緩下降的趨勢；80 ℃之后的提取率略有升高，但變化不大，并未超過70 ℃時的提取率，因此，中心組合實驗提取溫度的三個水平參數(shù)，選擇60 ℃、70 ℃、80 ℃.

3.2.3 提取時間對波棱瓜花水溶性多糖提取率的影響

根據(jù)3.2.1 提供的最佳料液比(1∶30)、3.2.2 提供的最佳提取溫度(70 ℃)，不同提取時間對水溶性多糖提取率影響的結(jié)果見表4、圖4.

表4 提取時間對水溶性多糖提取率的影響Table 4 Effect of time on the extraction yield of water－soluble polysaccharide

圖4 浸取時間對水溶性多糖提取率的影響Fig.4 Effect of time on the extraction yield of water－soluble polysaccharide

表4、圖4 表明:提取時間在0.5 ～1.5 h 之間時，波棱瓜花水溶性多糖提取率升高；提取時間在1.5 h～3 h 之間時，水溶性多糖提取率隨提取時間的延長而下降；提取時間在1.5 h 時，多糖提取率最大；而提取時間在3 ～3.5 h 之間時，多糖提取率雖有上升，但上升幅度較小.提取時間再多，提取率不會升高，反而雜質(zhì)的提取量會增加[19].因此選擇1 h、1.5 h、2 h 作為中心組合實驗時間的三個水平參數(shù).

3.3 響應(yīng)面實驗

3.3.1 回歸方程模型及方差分析

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇料液比、提取溫度、提取時間為自變量的影響因素，藏藥波棱瓜花多糖的提取率為響應(yīng)值，利用Design －Expert 軟件中Box －Behnken 組合設(shè)計法進行3 因素3 水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗；具體數(shù)據(jù)關(guān)于影響因素、影響水平和水溶性多糖提取率見表5 ～7.

表5 實驗設(shè)計的因素及水平編碼Table 5 The factors and level coding of experimental design

表6 Box－Behnken 試驗設(shè)計與試驗結(jié)果Table 6 Box－Behnken experimental design and results

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

將實驗結(jié)果導(dǎo)入Design －Expert 軟件進行分析，獲得響應(yīng)值與變異因素的多元二次回歸方程模型.回歸擬合后得到的波凌瓜花水溶性多糖提取率與各因素之間的回歸方程為:

Y ＝6. 35 － 0. 071A ＋0. 059B ＋0. 039C ＋0.057AB－0. 15AC ＋0. 29BC －0. 56A2－0. 64B2－0.89C2.

通過對該二次多元回歸模型進行顯著性檢驗及回歸模型系數(shù)顯著性檢驗，檢驗結(jié)果表明:二次多元回歸模型P 值＝0.0004，小于0.01，表明該模型差異極顯著；失擬項P ＝0.6554，大于0.05，無顯著性差異，說明模型與試驗值的差異較小. 從表中各因素的F 值和P 值可判斷，對波棱瓜花水溶性多糖提取率影響最大的是提取溫度與提取時間的交互作用；從單個因素來看，對提取率的影響力從大到小為:A(料液比) >B(提取溫度) >C(提取時間).

3.3.2 兩因素響應(yīng)面分析

1)料液比和提取溫度

圖5 料液比(A)與提取溫度(B)交互作用對水溶性多糖提取率的影響Fig.5 Interactive effects of solid－liquid ratio(A) and extraction temperature(B) on the extraction rate of polysaccharide

將C(提取時間)作為零水平，繪制A(料液比)和B(提取溫度)交互作用的響應(yīng)面三維面及等高線圖，結(jié)果見圖5.

圖5 表明:當(dāng)提取溫度為70 ℃、料液比為1∶30時，達(dá)到最高點，此時波棱瓜花水溶性多糖提取率最高；該響應(yīng)面雖有最高點，但圖形的變化不明顯，起伏較低，較為平緩，說明提取溫度在60 ～80 ℃，料液比在1∶30 左右時，其交互作用對水溶性多糖的提取率有一定影響，但影響不具顯著性.

2)料液比與提取時間

圖6 料液比(A)與提取時間(C)交互作用對水溶性多糖提取率的影響Fig.6 Interactive effects of solid－liquid ratio(A) and extraction time(C) on the extraction rate of polysaccharide

將B(提取溫度)作為零水平，繪制A(料液比)與C(提取時間)交互作用的響應(yīng)面三維面及等高線圖，結(jié)果見圖6.

圖6 表明:當(dāng)料液比為1∶30，提取時間在1.5 h左右時，響應(yīng)面有最高點，此時波棱瓜花水溶性多糖提取率最高，但是該響應(yīng)面圖形的變化起伏相對較低，說明料液比在1∶30，提取時間為1.5 h 時，其交互作用對水溶性多糖的提取率有一定影響，且顯著性比料液比與提取溫度(AB)的交互作用的更好.

3)提取溫度與提取時間

將A(料液比)作為零水平，繪制B(提取溫度)與C(提取時間)交互作用的響應(yīng)面三維面及等高線圖，結(jié)果見圖7.

圖7 提取溫度(B)與提取時間(C)交互作用對多糖提取提取率的影響Fig.7 Interactive effects of extraction temperature(B) and extraction time(C) on the extraction rate of polysaccharide

圖7 表明:當(dāng)提取溫度為70 ℃，提取時間為1.5 h，此時波棱瓜花水溶性多糖提取率達(dá)到最大，即響應(yīng)面的最高點. 該響應(yīng)面的等高圖形為橢圓形，結(jié)合3D 響應(yīng)曲面變化較大、陡峭彎曲，說明提取溫度與提取時間(BC)的交互作用對水溶性多糖提取率影響十分顯著.其中BC(提取溫度與提取時間)的交互作用影響最顯著.實驗結(jié)果結(jié)合軟件建議，確定最佳提取工藝為:料液比1∶30、溫度70 ℃、時間1.5 h，在此提取條件下波棱瓜花水溶性多糖提取率理論值為6.59%.

3.4 重復(fù)性檢測

綜上所述，A 料液比、B 提取溫度、C 提取時間對波棱瓜花水溶性多糖的提取率均有不同程度的影響，

按照確定的最佳提取工藝:料液比1 ∶30、溫度70 ℃、時間1.5 h，重復(fù)進行5 次平行試驗，結(jié)果見表8.

表8 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 8 Results of repeatability

根據(jù)Box －Behnken8.0.6.1 軟件優(yōu)化后的最佳工藝(料液比1∶30、提取溫度70 ℃、提取時間1.5 h)及“響應(yīng)值與變異因素的多元二次回歸方程模型”，波棱瓜花水溶性多糖提取率的最大理論值為6.59%，在此條件下進行5 次平行實驗，實際得到水溶性多糖提取率的平均值為6.35%，與理論值基本吻合.

4 討論與結(jié)論

本研究參考孫翠翠等[12，20－22]研究并作技術(shù)改進，采用單因素實驗結(jié)合響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化波棱瓜花水溶性多糖的提取工藝，具有經(jīng)濟、簡便等特點.研究結(jié)果表明:料液比、提取時間和提取溫度的二次項、提取溫度和提取時間的交互項對波棱瓜花水溶性多糖提取影響比較顯著.Box －Behnken8.0.6.1 軟件優(yōu)化后的最佳提取工藝:料液比1∶30、提取溫度70 ℃、提取時間1.5 h，波棱瓜花水溶性多糖提取率的最大理論值為6.59%.按照單因素實驗提供的最佳提取條件，重復(fù)進行5 次平行試驗，獲得波棱瓜花水溶性多糖實際平均提取率為6.35%，與理論值基本吻合. 因此，響應(yīng)面法優(yōu)化的波棱瓜花水溶性多糖提取工藝具有實踐意義，為藏藥波棱瓜花的深度開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)和研究材料.