紫花苜蓿低溫萌發(fā)特征及指標(biāo)篩選

侯龍魚(yú)，任立飛， 任麗昀，王天佐， 孫海蓮，伊風(fēng)艷， 白文明，2，張文浩，2

(1. 中國(guó)科學(xué)院植物研究所植被與環(huán)境變化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093；2.中國(guó)科學(xué)院內(nèi)蒙古草業(yè)研究中心，北京 100093；3. 太仆寺旗畜牧工作站，內(nèi)蒙古 錫林郭勒 027000；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；5.中國(guó)科學(xué)院內(nèi)蒙古草業(yè)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

大力發(fā)展人工草地是破解我國(guó)現(xiàn)代畜牧業(yè)和草牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途經(jīng)和抓手[1－2].苜蓿是世界上栽培歷史最悠久、種植面積最大的多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草[1，3].我國(guó)苜蓿種植區(qū)主要在北方地區(qū)，晚秋和早春播種溫度低且春季倒春寒時(shí)有發(fā)生，影響了苜蓿種子的萌發(fā)和出苗[1]. 因此，低溫條件下苜蓿種子的萌發(fā)和出苗特征對(duì)于田間苜蓿人工草地的成功建植起著關(guān)鍵的作用[1].苜蓿建植成功率和越冬率是我國(guó)北方尤其是高寒地區(qū)苜蓿人工草地種植的關(guān)鍵問(wèn)題，抗寒苜蓿品種選育多年來(lái)也一直是我國(guó)育種的主要目標(biāo)[1，3].

種子萌發(fā)期是作物完成生育周期最初始的時(shí)期，也是最為關(guān)鍵的時(shí)期[4－5].不同物種、品種、同一品種不同種子質(zhì)量、不同種源地等對(duì)種子的萌發(fā)和抗逆萌發(fā)均有一定的影響，而且這種萌發(fā)響應(yīng)品種間也存在著差異[6－7].劉懷華等在榆林地區(qū)10 種紫花苜蓿種子發(fā)芽試驗(yàn)表明，中苜1 號(hào)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)最高，根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)甘農(nóng)3 號(hào)最高[6].同時(shí)，苜蓿品種在響應(yīng)逆境條件時(shí)表現(xiàn)各異[7－8].目前的研究針對(duì)苜蓿植株耐寒越冬機(jī)制的研究較多，包括一些抗寒基因沙冬青脫水素基因(Dehydrin，AmDHN)、AtCBF1 基因的轉(zhuǎn)入等[9－12].種子抗逆萌發(fā)研究多集中在耐鹽上[2，7－8]，耐低溫萌發(fā)特征及其機(jī)制研究較少.敬雪敏和劉香萍研究了12 個(gè)苜蓿品種低溫下的耐鹽萌發(fā)能力[8]. 崔國(guó)文研究指出低溫脅迫下苜蓿萌發(fā)過(guò)程中各品種可溶性糖含量呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)，淀粉含量的變化呈先升高后降低的趨勢(shì)，且不同品種的兩者含量的變化程度不相同[13]. 苜蓿各萌發(fā)指標(biāo)的低溫響應(yīng)在品種間的差異性和比較也未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道. 因此，綜合比較苜蓿品種間耐低溫萌發(fā)能力，以及萌發(fā)指標(biāo)對(duì)低溫的響應(yīng)在品種間的差異，對(duì)于田間播種時(shí)選擇適宜苜蓿品種具有重要指導(dǎo)意義.

本文選擇6 個(gè)紫花苜蓿品種，比較各品種在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽溫度和低溫下的萌發(fā)特征，比較各品種發(fā)芽指標(biāo)對(duì)低溫的響應(yīng)及品種間的差異性.同時(shí)利用主成分分析法，篩選苜蓿品種對(duì)低溫響應(yīng)的指標(biāo)變量，為苜蓿品種耐低溫萌發(fā)能力的比較提供基礎(chǔ)，為我國(guó)北方紫花苜蓿播種與建植提供數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)選用6 份紫花苜蓿品種，其中自繁品種2份、種子田采收品種3 份，公司購(gòu)買品種1 份.所選試驗(yàn)品種均為國(guó)內(nèi)推廣和種植面積較大品種.WL363 為進(jìn)口品種，其他為國(guó)內(nèi)選育品種.品種、來(lái)源及收獲時(shí)間見(jiàn)表1.

表1 試驗(yàn)品種Table 1 Alfalfa varieties and sources

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽溫度(20 ℃)和低溫(4 ℃)條件下，開(kāi)展6 個(gè)紫花苜蓿品種培養(yǎng)試驗(yàn).選取種粒飽滿、大小一致的苜蓿種子，每組50 粒、3 次重復(fù).20 ℃培養(yǎng)置于賽福智能人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件20 ℃恒溫，每天16 小時(shí)光照，光照強(qiáng)度150 μmol m－2s－1，相對(duì)濕度80%.每天用蒸餾水補(bǔ)充水分.胚根突破種皮與種子直徑長(zhǎng)相等時(shí)判定為萌發(fā).每天記錄發(fā)芽種子數(shù)，培養(yǎng)12 d 后，結(jié)束發(fā)芽試驗(yàn).每皿選取10 株苗測(cè)定根長(zhǎng).同時(shí)，低溫(4 ℃)培養(yǎng)置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間同為12 d.發(fā)芽率，發(fā)芽指數(shù)，平均萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)整齊性指數(shù)的計(jì)算均參考文獻(xiàn)Ranal 等[14]和Liu 等[15].

為了減少和消除苜蓿種子初始指標(biāo)間的差異性，選擇相對(duì)萌發(fā)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)低溫萌發(fā)對(duì)發(fā)芽的影響程度以及指標(biāo)間的關(guān)系.標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽溫度(20 ℃)條件下各指標(biāo)為1，低溫培養(yǎng)下的各指標(biāo)的比例即為相對(duì)指標(biāo)[4].

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用單因素方差分析(One －way ANOVA)比較各苜蓿品種在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽溫度(20 ℃)和低溫(4 ℃)培養(yǎng)時(shí)各發(fā)芽指標(biāo)的差異性.運(yùn)用t－test 比較各品種在兩個(gè)萌發(fā)溫度中萌發(fā)指標(biāo)的差異性.運(yùn)用相關(guān)分析法比較5 個(gè)萌發(fā)指標(biāo)之間的相關(guān)性.運(yùn)用主成分分析法分析低溫萌發(fā)代表性的主成分指標(biāo).根據(jù)提取的主成分指標(biāo)變量計(jì)算各品種得分，對(duì)苜蓿品種低溫萌發(fā)特征排序.方差分析與多重比較、相關(guān)分析和主成分分析均用SPSS21.0 軟件輔助完成. 圖由SigmaPlot10.0輔助完成.

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿種子萌發(fā)指標(biāo)比較與分析

在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽溫度20 ℃和低溫4 ℃條件下，6 個(gè)苜蓿品種間發(fā)芽指標(biāo)均有顯著差異(圖1).20 ℃培養(yǎng)，發(fā)芽率中苜1 號(hào)最高、敖漢最低，平均萌發(fā)時(shí)間敖漢和草原3 號(hào)最長(zhǎng)、WL363 最短，萌發(fā)整齊性指數(shù)中科1 號(hào)、中科2 號(hào)和中苜1 號(hào)最高、敖漢和草原3 號(hào)最低，發(fā)芽指數(shù)中苜1 號(hào)和WL363 最高，敖漢最低，根長(zhǎng)中科1 號(hào)和WL363 最長(zhǎng)、敖漢最短(圖1a － e).4 ℃培養(yǎng)，發(fā)芽率中苜1 號(hào)最高、敖漢最低，平均萌發(fā)時(shí)間敖漢最長(zhǎng)、中科2 號(hào)、中苜1 號(hào)和WL363 最短，萌發(fā)整齊性指數(shù)中科1 號(hào)顯著高于中苜1 號(hào)和WL363，發(fā)芽指數(shù)中科1 號(hào)、中苜1 號(hào)和WL363 顯著高于敖漢和草原3 號(hào)，根長(zhǎng)中科2 號(hào)最長(zhǎng)，敖漢最短(圖1a－e). 綜合各指標(biāo)看，低溫條件下，中科1 號(hào)、中科2 號(hào)、中苜1 號(hào)和WL363 萌發(fā)能力強(qiáng)于敖漢和草原3 號(hào).

同一品種培養(yǎng)溫度間比較，發(fā)芽率中科1 號(hào)兩個(gè)溫度間沒(méi)有顯著差異(圖1a)，萌發(fā)整齊性指數(shù)敖漢和草原3 號(hào)兩個(gè)溫度間沒(méi)有顯著差異(圖1c)，其他各品種各指標(biāo)兩個(gè)培養(yǎng)溫度均有顯著差異(圖1a －e).因此，中科1 號(hào)低溫萌發(fā)能力在6 個(gè)品種中較強(qiáng)，尤其表現(xiàn)在發(fā)芽率上.

為了減少或排除種子質(zhì)量本身造成的發(fā)芽差異，利用相對(duì)發(fā)芽指標(biāo)評(píng)價(jià)低溫下各品種間的發(fā)芽能力(表2).相對(duì)發(fā)芽率敖漢顯著低于其他五個(gè)品種，相對(duì)平均萌發(fā)時(shí)間中科1 號(hào)、敖漢和WL363 最低，相對(duì)萌發(fā)整齊性指數(shù)草原3 號(hào)和敖漢最高，相對(duì)發(fā)芽指數(shù)中科1 號(hào)和WL363 顯著高于敖漢和草原3 號(hào)，相對(duì)根長(zhǎng)中科2 號(hào)最高(表2). 因此，中科1 號(hào)、中科2號(hào)、中苜1 號(hào)和WL 耐低溫萌發(fā)能力相對(duì)較強(qiáng).

綜合各萌發(fā)指標(biāo)和相對(duì)萌發(fā)指標(biāo)，品種耐低溫萌發(fā)能力中科1 號(hào)、中科2 號(hào)、中苜1 號(hào)和WL363 強(qiáng)于敖漢和草原3 號(hào)，中科1 號(hào)突出表現(xiàn)在發(fā)芽率上，中科2 號(hào)突出表現(xiàn)在根長(zhǎng)上.

圖1 萌發(fā)溫度對(duì)苜蓿品種間發(fā)芽指標(biāo)的影響Fig. 1 Effect of normal and low－temperature on germination indexes of alfalfa varieties

表2 低溫條件下發(fā)芽指標(biāo)相對(duì)值Table 2 Relative values of germination indexes under 4 ℃incubation condition.

2.2 苜蓿種子低溫萌發(fā)各指標(biāo)相關(guān)性

種子萌發(fā)各指標(biāo)間既有差別，又存在著聯(lián)系性.各發(fā)芽指標(biāo)對(duì)低溫培養(yǎng)的響應(yīng)以及響應(yīng)程度有不同程度的差異性(圖1，表2).通過(guò)相對(duì)發(fā)芽指標(biāo)相關(guān)性比較，分析各指標(biāo)響應(yīng)低溫培養(yǎng)的變化. 相對(duì)根長(zhǎng)與相對(duì)發(fā)芽率(r ＝0.698??，P <0.01)、相對(duì)平均萌發(fā)時(shí)間(r ＝0.659??，P <0.01)、相對(duì)萌發(fā)整齊性指數(shù)(r ＝－0.601??，P <0.01)和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)(r ＝0.598??，P<0.01)均有顯著相關(guān)性(表3). 相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)也有顯著相關(guān)性(r ＝0. 947??，P<0.01).因此，相對(duì)根長(zhǎng)和其他相對(duì)發(fā)芽指數(shù)相關(guān)性密切，其他相對(duì)發(fā)芽指標(biāo)間關(guān)系較小.

表3 低溫培養(yǎng)各發(fā)芽指標(biāo)相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficients of germination indexes under 4 ℃incubation condition

2.3 苜蓿種子低溫萌發(fā)各指標(biāo)主成分分析

相關(guān)分析結(jié)果表明，低溫培養(yǎng)下苜蓿種子萌發(fā)各指標(biāo)間相關(guān)性有差異(表3).因此采用主成分分析法，通過(guò)降維的方法篩選低溫萌發(fā)時(shí)苜蓿萌發(fā)的評(píng)價(jià)指標(biāo).主成分分析結(jié)果表明第一個(gè)主成分提取特征值3.209，占到總信息量的64.18%，其他主成分提取特征值均小于1.同時(shí)，主成分1 包含測(cè)定5 個(gè)指標(biāo)的大部分信息，表現(xiàn)為五個(gè)指標(biāo)的載荷系數(shù)均超過(guò)0.6(表4).因此，主成分1 可以用作苜蓿低溫萌發(fā)的指標(biāo).

根據(jù)表4 提取主成分系統(tǒng)矩陣，據(jù)此可獲得各品種在主成分1 中的得分公式[17]，如下:

F ＝0.910X1＋0.646X2－0.702X3＋0.820X4＋0.893X5

根據(jù)F 值，對(duì)6 個(gè)苜蓿品種進(jìn)行低溫萌發(fā)響應(yīng)得分排序(表5)，中苜1 號(hào)、中科2 號(hào)、中科1 號(hào)、WL363、草原3 號(hào)和敖漢依次下降.

表4 低溫培養(yǎng)苜蓿發(fā)芽指標(biāo)主成分分析Table 4 Principal component analysis of germination indexes under 4 oC incubation condition

表5 各品種低溫萌發(fā)得分排序Table 5 The order of germinability under 4 oC incubation condition for alfalfavarieties

3 討論

低溫抑制苜蓿種子的萌發(fā)，表現(xiàn)為發(fā)芽率和發(fā)芽活力指數(shù)下降、平均萌發(fā)時(shí)間增加，相同萌發(fā)時(shí)間內(nèi)根長(zhǎng)變短(圖1)，該結(jié)果與前人研究結(jié)果相同[13].這與低溫抑制了苜蓿種子內(nèi)相應(yīng)的生理過(guò)程，尤其是酶的活性和激素變化有關(guān)[13].

苜蓿品種萌發(fā)指標(biāo)對(duì)低溫萌發(fā)的響應(yīng)不同(圖1，表2)，中科1 號(hào)發(fā)芽率耐低溫能力最強(qiáng)，中科2 號(hào)胚根生長(zhǎng)耐低溫能力最強(qiáng)，耐低溫萌發(fā)綜合指標(biāo)以中苜1 號(hào)主成分1 得分最高. 因此，選擇綜合的耐低溫萌發(fā)指標(biāo)，評(píng)價(jià)物種間的耐低溫萌發(fā)能力對(duì)于全面評(píng)價(jià)品種間耐低溫能力更具有優(yōu)勢(shì).趙陽(yáng)佳等利用模糊隸屬函數(shù)法得出7 種綠肥作物耐低溫萌發(fā)能力的綜合評(píng)價(jià)[16].陶金等利用主成分分析法得出燕麥品種間耐鹽萌發(fā)能力的綜合評(píng)價(jià)[4].本研究通過(guò)主成分分析法得出苜蓿品種間影響低溫萌發(fā)品種評(píng)價(jià). 同時(shí)，在綜合評(píng)價(jià)的同時(shí)，一些重要的指標(biāo)也有生產(chǎn)的意義，如低溫發(fā)芽率可以作為田間播種量主要參考依據(jù)，低溫根系生長(zhǎng)速率可以作為田間出苗快慢的依據(jù).因此，在評(píng)價(jià)品種的耐低溫能力時(shí)，要同時(shí)考慮關(guān)鍵發(fā)芽指標(biāo)，也需要綜合評(píng)價(jià)耐低溫萌發(fā)能力.

作物的耐低溫能力是受多種因素共同影響，萌發(fā)期鑒定出的較強(qiáng)抗性的種質(zhì)材料是否在苗期或者整個(gè)生育期也具有同樣的抗性，尚需要更進(jìn)一步的室內(nèi)和田間試驗(yàn)的驗(yàn)證[16].

4 結(jié)論

苜蓿品種間低溫萌發(fā)能力存在差異，中科1 號(hào)耐低溫能力表現(xiàn)在低溫下發(fā)芽率較高，中科2 號(hào)表現(xiàn)在根長(zhǎng)最長(zhǎng)，主成分分析表明，主成分1 占5 個(gè)發(fā)芽指標(biāo)信息量的64.18%，可以很好的表征苜蓿的低溫萌發(fā)能力，根據(jù)主成分1 計(jì)算得分，中苜1 號(hào)、中科2號(hào)、中科1 號(hào)、WL363、草原3 號(hào)和敖漢苜蓿低溫萌發(fā)能力依次減弱.