牦牛DIO2 基因克隆及其在骨骼肌的表達(dá)分析

熊 燕，趙 丹，劉靜怡，石 超，宋紫文，華永林，張 靜，柏 雪，李 鍵，熊顯榮

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3.西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

牦牛(Bos grunniens)是青藏高原及其毗鄰高山、亞高山地區(qū)的特有畜種，素有“高原之舟”的美稱. 牦牛肉具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是符合現(xiàn)代市場(chǎng)需求的綠色食品[1].畜禽胴體中最主要的組織為骨骼肌，其生長(zhǎng)發(fā)育速度決定畜禽的產(chǎn)肉性能，肌纖維類型的組成與肌肉的品質(zhì)緊密相關(guān)[2].目前根據(jù)肌纖維能量代謝特點(diǎn)，可將其劃分為氧化型(I 型)、氧化糖酵解型(IIa/IIx 型)和糖酵解型(IIb 型)，其中I 和IIb 型分別為典型的快肌和慢肌纖維. 研究表明在牦牛肉中，快肌纖維含量越高，牦牛肉初始嫩度越差，肉質(zhì)的嫩度改善差，反之亦然[3].因此，研究畜禽骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育及肌纖維類型組成對(duì)增加畜禽產(chǎn)肉性能及改善肉質(zhì)極其重要.

哺乳動(dòng)物骨骼肌的生長(zhǎng)、肌纖維類型決定及其轉(zhuǎn)化受到機(jī)體激素水平的調(diào)控.科學(xué)家發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素對(duì)小鼠骨骼肌肌纖維有決定作用[4]，缺乏甲狀腺激素，會(huì)降低四頭肌RNA、蛋白質(zhì)及細(xì)胞色素的含量[5]；在鳥(niǎo)類的研究中，機(jī)體內(nèi)甲狀腺激素升高導(dǎo)致鳥(niǎo)類骨骼肌的再生[6]，以上研究表明甲狀腺素信號(hào)通路參與調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)及肌纖維類型的形成.甲狀腺激素主要由血液中的酪氨酸碘化物四碘甲腺原氨酸(Tetraiodothyronine，T4)和組織中有生物活性的三碘甲腺原氨酸(Triiodothyronine，T3)組成，其作用絕大部分取決于T3 的含量[7].研究報(bào)道T3 的合成通過(guò)脫碘酶經(jīng)脫碘作用將T4 轉(zhuǎn)化為T3[5]，該過(guò)程中有三種脫碘酶參與，即Ⅰ型(type 1 deiodinase，D1)、II 型(type 2 deiodinase，D2)和Ⅲ型脫碘酶(type 3 deiodinase，D3)[8]，其中DIO2(typeⅡiodothyroninedeiodinase gene)作為2 型脫碘酶基因，在動(dòng)物的多個(gè)組織和器官中均有表達(dá)[9].最新發(fā)現(xiàn)DIO2 的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠骨骼肌肌纖維的類型向快肌轉(zhuǎn)化，提高IIb 型快肌纖維的數(shù)量[10].然而牦牛與上述動(dòng)物相比，由于高原環(huán)境的長(zhǎng)期選擇作用，導(dǎo)致其骨骼肌的生長(zhǎng)及肌纖維類型的組成具有特異性，DIO2 是否參與上述生物學(xué)過(guò)程未知.

因此，本實(shí)驗(yàn)首先克隆牦牛DIO2 基因的CDS 序列，然后利用生物信息學(xué)方法分析DIO2 基因在物種間的保守性及預(yù)測(cè)其理化性質(zhì)，最后采用qRT －PCR分析DIO2 在金川牦牛和麥洼牦牛骨骼肌的差異表達(dá)，為后續(xù)研究DIO2 基因在骨骼肌的功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

4 歲左右的金川公牦牛和麥洼公牦牛各4 頭，均由四川阿壩羌族藏族自治州金川縣慶林鄉(xiāng)牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)提供. 屠宰后立即采集肝、脾、肺、腎、皮下脂肪、背最長(zhǎng)肌和半腱肌等組織，放置于液氮罐中，置于－80 ℃低溫儲(chǔ)藏備用.

1.1.2 主要儀器及試劑

PCR 儀(Bio－Rad C1000)、Trizol 試劑、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pGM －T 鏈接試劑盒與大腸桿菌(Escherichia coli)DH5 a感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自于成都鵬世達(dá)實(shí)驗(yàn)用品有限公司；熒光定量試劑盒、DL 2000 DNA Marker 及LA Taq 酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(Takara 中國(guó)).

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中牦牛DIO2 的預(yù)測(cè)序列(GenBank 注冊(cè)號(hào):XM＿014482051.1)進(jìn)行克隆引物的設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)軟件為Primer premier 5.0.如表1 所示，引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成.

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄

組織總RNA 由Trizol 試劑提取，然后采用微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)總RNA 濃度及OD260/OD280 值，此值在1.8 ～2.0 則符合要求，置于－80 ℃保存?zhèn)溆?按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA 的合成.

1.2.3 牦牛DIO2 基因克隆

以4 頭金川牦牛肌肉組織cDNA 為模板，PCR 反應(yīng)體系如下:上下游引物(10 μM)各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 5.5 μL，PCR Mix 7.5 μL.PCR 反應(yīng)程序如下:94 °C 預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，退火溫度61 ℃45 s，72 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min.

將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%凝膠電泳，對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收.將膠回收產(chǎn)物與pGM －T 載體16 ℃連接過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)化入DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，吸取適量菌液涂于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 ～16 h，挑選3 ～5 個(gè)克隆擴(kuò)大培養(yǎng).將菌液送往成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接得到DIO2 基因的CDS 全長(zhǎng)序列.

1.2.4 牦牛DIO2 生物信息學(xué)分析

根據(jù)獲得的牦牛DIO2 的CDS 序列，分別做如下7 個(gè)方面的生物信息學(xué)分析:(1)NCBI 的ORF Finder(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)尋找開(kāi)放閱讀框，獲得氨基酸序列.(2)NCBI 中BLAST 軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，然后利用MEGA5.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù).(3)ProtParam 軟件分析牦牛DIO2 基因的理化性質(zhì).(4)ProtScale 軟件在線分析牦牛DIO2 基因蛋白的親疏水性.(5)TMpred 軟件在線蛋白質(zhì)的跨膜區(qū). (6)NetPhos 3.1 Server 軟件對(duì)DIO2 蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè).(7)分別用HNN 在線工具和SWISS －MODEL 軟件預(yù)測(cè)牦牛DIO2 蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu).

1.2.5 qRT－PCR

利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)目的基因的熒光定量特異引物，如表1 所示，引物送往成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成.內(nèi)參基因選用環(huán)孢素A 受體(peptidylprolylisomerase A，PPIA). 以上述的cDNA 為模板，采用qRT －PCR 法檢測(cè)DIO2 在牦牛各組織中的表達(dá)差異. 反應(yīng)體系如下:上下游引物各0.3 μL，RNase－freeddH2O 2.9 μL，cDNA 模板4 μL，SYBR Green 7.5 μL. PCR 反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán).定量所得數(shù)據(jù)利用2－ΔΔCt法進(jìn)行分析.結(jié)果采用SPSS 18.0 分析軟件中的ANOVA 程序進(jìn)行單因素方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛DIO2 基因序列結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)以肌肉組織的cDNA 為模板，利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)DIO2 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖1A 所示，結(jié)果如圖1A 所示，克隆得到牦牛DIO2 基因的序列總長(zhǎng)度為839 bp，其CDS 區(qū)全長(zhǎng)為789 bp.將條帶進(jìn)行膠回收后，連接pGM －T 載體，送往公司進(jìn)行雙向測(cè)序，拼接序列與預(yù)測(cè)結(jié)果一致(如圖1B).然后將牦牛DIO2 基因利用NCBI ORF Finder 進(jìn)行開(kāi)放閱讀框分析，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)399 bp 的開(kāi)放閱讀框，編碼132 個(gè)氨基酸.

圖1 牦牛DIO2 基因克隆Fig. 1 Gene clone of DIO2 in yak

2.2 牦牛DIO2 基因在不同物種之間的同源性比較

利用NCBI 中BLAST 分析模塊，對(duì)普通牛(Bosta-urus)、綿羊(Ovisaries)、山羊(Capra hircus)、豬(Suss-crofa)、家貓(Feliscatus)、人(Homo sapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)、大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Mus-musculus)、和原雞(Gallus gallus)的DIO2 基因的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì). 如表2 所示，牦牛與普通牛的核苷酸和氨基酸同源性高達(dá)100%，與原雞的同源性較低，分別為79.17%和76.30%.然后利用MEGA5.0 軟件根據(jù)序列的同源性構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，聚類結(jié)果與同源性比對(duì)結(jié)果一致，如圖2 所示牦牛和普通牛聚為一類，牦牛與同為反芻動(dòng)物的綿羊和山羊親緣關(guān)系最近，與原雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn).

表2 牦牛DIO2 基因與其他物種的核苷酸及氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Table 2 Nucleotide and amino acid sequence alignment of yak DIO2 gene with other species

圖2 牦牛與其他物種的DIO2 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of DIO2 gene in yak and other species

2.3 DIO2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用ProtParam 軟件分析顯示牦牛DIO2 蛋白分子質(zhì)量為14 484.75. 含有20 種氨基酸，其中Leu 和Ser 含量較高，所占比例為15.2%和11.4%；Trp 色氨酸和Tyr 酪氨酸含量較低，均為1.5%(表3). DIO2蛋白理論等電點(diǎn)(pI)為6.26，有13 個(gè)帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp ＋Glu)，12 個(gè)帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg＋Lys).其在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，屬于不穩(wěn)定蛋白.

表3 牦牛DIO2 基因氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of yak DIO2 gene

利用ProtScale 軟件分析顯示，牦牛DIO2 蛋白表現(xiàn)為疏水性(圖3A).如圖3B，TMpred 軟件分析發(fā)現(xiàn)DIO2 蛋白質(zhì)在第16 ～37 位具有跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)(分值>0 表明存在跨膜區(qū)域). NetPhos 3.1 Server 軟件預(yù)測(cè)牦牛DIO2 蛋白有15 個(gè)絲氨酸(Ser5、Ser20、Ser30、Ser42、Ser44、Ser46、Ser57、Ser66、Ser84、Ser85、Ser90、Ser91、Ser98、Ser119 和Ser130)、7 個(gè)蘇氨酸(Thr11、Thr47、Thr56、Thr97、Thr106、Thr110 和Thr132)及2 個(gè)酪氨酸(Tyr28 和Tyr72)磷酸化位點(diǎn)(圖3C)，推測(cè)這些磷酸化位點(diǎn)可能與DIO2 的激酶活性有關(guān). 此外，HNN 在線工具預(yù)測(cè)DIO2 蛋白主要由a －螺旋(59 個(gè)氨基酸殘基，Hh:44.7%)、無(wú)規(guī)則卷曲(51 個(gè)氨基酸殘基，Cc:38.64%)和延伸鏈(22 個(gè)氨基酸殘基，Ee:16.67%)組成(圖3D).通過(guò)SWISS －MODEL 軟件預(yù)測(cè)牦牛DIO2 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖3.E 所示，該三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，由無(wú)規(guī)則卷曲、a－螺旋和延伸鏈三者交替出現(xiàn).

圖3 DIO2 基因生物信息學(xué)分析Fig. 3 Bioinformatic analysis of DIO2 in yak

2.4 牦牛DIO2 基因組織表達(dá)分析

利用qRT－PCR 方法檢測(cè)DIO2 基因在牦牛不同組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示DIO2 基因在牦牛脾、肺等內(nèi)臟組織均有表達(dá)，但組織間差異不顯著(圖4A).在脂肪、肝、骨骼肌等能量代謝相關(guān)組織的表達(dá)中，脂肪的表達(dá)量最低，背最長(zhǎng)肌和半腱肌的表達(dá)量極顯著高于脂肪組織和肝臟組織(P <0.01)，如圖4B 所示.不同部位骨骼肌表達(dá)量比較研究發(fā)現(xiàn)，牦牛半腱肌DIO2基因的表達(dá)量具有高于背最長(zhǎng)肌的趨勢(shì)(P ＝0.06，圖4B).進(jìn)一步對(duì)金川牦牛和麥洼牦牛比較分析顯示，肉質(zhì)相對(duì)細(xì)嫩的金川牦半腱肌的DIO2 表達(dá)量顯著高于麥洼牦牛(P <0.05，圖4C). 綜上表明，DIO2 在骨骼肌中具有較高的表達(dá)量，且金川牦牛半腱肌的表達(dá)量高于麥洼牦牛.

圖4 牦牛DIO2 基因的組織表達(dá)分析Fig. 4 Tissue expression analysis of DIO2 gene in yak

3 討論

本實(shí)驗(yàn)克隆了牦牛DIO2 基因的CDS 序列全長(zhǎng)為798 bp，有一個(gè)399 bp 的開(kāi)放閱讀框，編碼132 個(gè)氨基酸.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)DIO2 是一種不穩(wěn)定的疏水性蛋白，蛋白結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則卷曲和螺旋構(gòu)成. 物種同源性分析發(fā)現(xiàn)牦牛與普通牛同源，并且與其他幾個(gè)物種之間的同源性也相對(duì)較高，可推測(cè)出DIO2 基因序列在物種間高度保守.

目前研究報(bào)道了DIO2 基因在下丘腦、大腦、小腦、甲狀腺、睪丸、子宮等性腺軸相關(guān)組織的表達(dá)[11－12]，本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了DIO2 基因在牦牛的脾、肺、腎、肝、脂肪、半腱肌和背最長(zhǎng)肌的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DIO2 基因在骨骼肌中有較高的表達(dá)量. DIO2 基因參與調(diào)控腎上腺素T3 的生成，大量研究表明骨骼肌為腎上腺素作用的主要靶組織，調(diào)節(jié)出生后動(dòng)物肌肉的發(fā)育、生長(zhǎng)及能量代謝[13－15].本研究發(fā)現(xiàn)牦牛半腱肌DIO2基因的表達(dá)量與背最長(zhǎng)肌相比，具有較高的趨勢(shì). 以前的研究報(bào)道不同部位肌肉組織肌纖維類型組成比例存在較大差異，半腱肌與背最長(zhǎng)肌相比，半腱肌的慢肌比例較高[16]. 在其他物種中，敲除小鼠DIO2 基因抑制骨骼肌中T4 向T3 的轉(zhuǎn)換，降低骨骼肌T3 的水平，導(dǎo)致比目魚(yú)肌中慢肌纖維的比例下降[17].因此我們推測(cè)DIO2 可能與骨骼肌慢肌纖維類型的決定有關(guān).此外，金川牦牛和麥洼牦牛的比較分析發(fā)現(xiàn)，金川牦牛半腱肌DIO2 基因的表達(dá)量顯著高于麥洼牦牛，本課題組前期對(duì)二者舍飼育肥條件下肌肉品質(zhì)比較，表明金川牦牛肉肌肉剪切力低，肉質(zhì)相對(duì)細(xì)嫩，并且肌內(nèi)脂肪含量較高[18]. 研究報(bào)道，DIO2 基因調(diào)控脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積及脂肪酸的代謝[19]，是否其參與肌內(nèi)脂肪的沉積需要進(jìn)一步研究.綜上分析，DIO2 基因可能在骨骼肌的生長(zhǎng)及慢肌纖維類型的決定方面的調(diào)控發(fā)揮重要作用.

牦牛長(zhǎng)期處于高原缺氧環(huán)境下，其骨骼肌發(fā)育及肌纖維類型形成的分子機(jī)制具有特異性[20]. 研究表明動(dòng)物在低氧環(huán)境下，組織中線粒體的密度顯著升高，肌纖維的生長(zhǎng)相對(duì)緩慢[21－22]. T3 直接處理小鼠骨骼肌2h 后，導(dǎo)致骨骼肌快肌和慢肌中P38 和AMPK 的磷酸化水平升高[17]，同樣大鼠注射T3，可快速激活骨骼肌纖維中的激酶，這些激酶涉及線粒體的生成、體積的增加及肌纖維的收縮[23]. 此外，研究報(bào)道骨骼肌線粒體的融合，會(huì)促進(jìn)慢肌纖維形成[24].盡管本研究顯示DIO2 基因在半腱肌的表達(dá)量高于背最長(zhǎng)肌，半腱肌的慢肌纖維含量與背最長(zhǎng)肌相比，較為豐富[16].但考慮到牦牛所處高原環(huán)境的長(zhǎng)期影響，DIO2 基因調(diào)控其骨骼肌生長(zhǎng)及肌纖維類型決定的分子機(jī)制需要進(jìn)一步的研究.

4 結(jié)論

本研究成功克隆出了牦牛DIO2 基因序列，CDS序列全長(zhǎng)為798bp，編碼132 個(gè)氨基酸.通過(guò)同源性對(duì)比，發(fā)現(xiàn)DIO2 在物種間高度保守.組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)DIO2 基因在牦牛各個(gè)組織中均有表達(dá)，但在骨骼肌中的表達(dá)量最高. 金川牦牛與麥洼牦牛比較分析顯示，金川牦牛DIO2 基因在半腱肌的表達(dá)量顯著高于麥洼牦牛.