獨(dú)角石斛組培快繁技術(shù)

陳 春

(福建省林業(yè)科技試驗(yàn)中心，福建 南靖 363600)

石斛蘭屬(Dendrobium)為蘭科(Orchidaceae)中的三大屬之一，有近2 000種原生種，主要分布在亞洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)及大洋洲[1]。石斛蘭花色鮮艷、擺放觀賞時(shí)間長(zhǎng)且品種繁多，園藝及觀賞價(jià)值較高。獨(dú)角石斛是石斛蘭的一個(gè)小型種，其唇瓣反轉(zhuǎn)似犀牛角，花瓣橙紅色，唇瓣上布有深橙紅色網(wǎng)紋。通常利用觀賞石斛的植株側(cè)芽進(jìn)行分株繁殖以獲得種苗。但蘭科植物不易發(fā)芽，分株繁殖慢且生長(zhǎng)不一致，因此，組培技術(shù)在觀賞石斛上的應(yīng)用前景廣闊[2-3]。近年來，國(guó)內(nèi)已有石斛蘭組培方面的研究，大多以其種子作為外植體，較少以側(cè)芽作為外植體[4-11]。本試驗(yàn)以獨(dú)角石斛側(cè)芽為外植體，對(duì)組培過程進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為觀賞石斛組培快繁及規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為栽培于福建省林業(yè)科技試驗(yàn)中心五板橋基地溫室中的2年生獨(dú)角石斛，取其生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的當(dāng)年生側(cè)芽作為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒與誘導(dǎo) 在天氣晴朗的下午，剪取生長(zhǎng)健壯、無病蟲害獨(dú)角石斛側(cè)芽為外植體。將剪下的側(cè)芽用0.1%洗衣粉浸泡5 min左右，之后切成5 cm莖段，用自來水沖洗3～5遍，放置于超凈工作臺(tái)上。用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精溶液消毒 30～60 s，再用HgCl2消毒15～20 min，最后用無菌水沖洗3～5遍，切割成2～3 cm莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS+0.2 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂為基本培養(yǎng)基，并添加了不同質(zhì)量濃度的6-BA。6-BA是石斛蘭芽誘導(dǎo)較為重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，適宜的濃度有利于不定芽的增殖。6-BA分別設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1，誘導(dǎo)培養(yǎng)基相應(yīng)代號(hào)為Y1～Y6。每種培養(yǎng)基接種30 瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種1個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計(jì)污染情況，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率。

污染率/%=(污染的外植體瓶數(shù)/接種瓶數(shù))×100

誘導(dǎo)率/%=(外植體分化瓶數(shù)/無菌瓶數(shù))×100

表1 獨(dú)角石斛增殖培養(yǎng)試驗(yàn)的因子水平表Table 1 Factors and levels of proliferation culture test

1.2.2 不定芽的增殖培養(yǎng) 將誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的不定芽切下，接到繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。6-BA和KT有利于不定芽的增殖，少量NAA有利于不定芽的生長(zhǎng)。為此，以MS+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質(zhì)量濃度的6-BA、KT、NAA(表1)。利用L9(34)正交試驗(yàn)，分析不同激素水平對(duì)獨(dú)角石斛叢生芽增殖系數(shù)的影響。每個(gè)處理接種30瓶，每瓶接種1個(gè)不定芽，3次重復(fù)。45 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的增殖及生長(zhǎng)情況。

1.2.3 不定芽的壯苗生根培養(yǎng) 將繼代增殖培養(yǎng)獲得的3 cm以上的叢生芽切下，接種到壯苗生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。生長(zhǎng)素NAA和IBA對(duì)不定根的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)以1/2MS+0.5 g·L-1AC+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉膠為基本培養(yǎng)基，添加50 g·L-1土豆、50 g·L-1香蕉泥， NAA分別設(shè)置為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·L-1，IBA為0.5 mg·L-1，壯苗生根培養(yǎng)基代號(hào)為R1～R5。比較不同質(zhì)量濃度NAA及IBA對(duì)獨(dú)角石斛生根情況的影響。每種培養(yǎng)基接種30瓶，每瓶接5叢， 3次重復(fù)，45 d后統(tǒng)計(jì)生根苗生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 組培苗的移栽 當(dāng)壯苗生根培養(yǎng)獲得的生根苗長(zhǎng)至5 cm以上，將瓶苗煉苗15 d后即可移栽。清洗組培苗根部的殘留培養(yǎng)基，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%多菌靈消毒15 s，之后種植在消毒處理過的水苔及樹皮屑基質(zhì)中，于溫室大棚中培育。由于水苔和樹皮屑的透氣性和保水性好，適合石斛蘭的移栽，本試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理：T1為水苔；T2為水苔與樹皮屑以1∶1混合；T3為樹皮屑。每種培養(yǎng)基質(zhì)種植30叢組培苗，3次重復(fù)。栽培期間應(yīng)注意遮蔭、噴水保濕，移栽45 d后觀察小苗的移栽成活率及生長(zhǎng)情況。

1.2.5 培養(yǎng)條件 組培培養(yǎng)室溫度為23～25 ℃，光照周期為10 h·d-1，光照強(qiáng)度為2 000 lx；溫室大棚濕度控制在70%～85%，溫度25～30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA質(zhì)量濃度對(duì)獨(dú)角石斛不定芽誘導(dǎo)的影響

外植體培養(yǎng)15 d左右，不定芽開始萌發(fā)，30 d左右可統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率。由表2可知，不同質(zhì)量濃度6-BA對(duì)不定芽的誘導(dǎo)率存在顯著差異。 當(dāng) 6-BA<1.0 mg·L-1或>2.0 mg·L-1時(shí)，不利于不定芽的誘導(dǎo);當(dāng) 6-BA為2.0 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率最高，達(dá)95.5%，不定芽生長(zhǎng)健壯，葉片綠色；上升至3.0 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率降低，不定芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。因此，以獨(dú)角石斛側(cè)芽為外植體可誘導(dǎo)出不定芽，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基MS中添加2.0 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1NAA，不定芽的誘導(dǎo)效果最好。

表2 6-BA質(zhì)量濃度對(duì)獨(dú)角石斛外植體誘導(dǎo)的影響1)Table 2 Effects of 6-BA concentrations on the inductions of D.unicorneum explants

1)同列數(shù)值后附不同大小寫字母者分別表示差異達(dá)0.01、0.05顯著水平。

2.2 不同激素對(duì)獨(dú)角石斛不定芽增殖的影響

圖1 獨(dú)角石斛繼代瓶苗Figure 1 Subculture seedlings of D.unicorneum

不定芽接種到繼代增殖培養(yǎng)基后，其增殖速度快，45 d后可長(zhǎng)成叢狀(圖1)。方差分析表明，對(duì)獨(dú)角石斛增殖系數(shù)影響最大的因素是6-BA，其次是KT，這兩個(gè)因素的P值均為0，說明6-BA和KT對(duì)增殖系數(shù)的影響極顯著(表3)。NAA對(duì)獨(dú)角石斛增殖系數(shù)的影響不顯著。

正交試驗(yàn)方差分析顯示，5號(hào)獨(dú)角石斛增殖系數(shù)(4.78)最大，在0.01水平上顯著差異于其他處理的培養(yǎng)基(表4)。因此，選擇獨(dú)角石斛的最適增殖培養(yǎng)基為：MS+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1KT+0.4 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂。

表3 正交設(shè)計(jì)方差分析表Table 3 ANOVA Table of orthogonal design

2.3 培養(yǎng)基對(duì)獨(dú)角石斛生根誘導(dǎo)的影響

當(dāng)不定芽長(zhǎng)至3 cm時(shí)，將其切下并轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上，經(jīng)25 d的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，可獲得生根組培苗(圖2)。由表5可知，當(dāng)NAA<0.4 mg·L-1時(shí)，不定根的生根率和生根條數(shù)均隨著NAA濃度的提高而增加，R1～R3處理生根條數(shù)呈極顯著差異；當(dāng)NAA為0.4 mg·L-1時(shí)，生根率達(dá)100%，根數(shù)達(dá)5.7條；當(dāng)NAA>0.4 mg·L-1時(shí)，對(duì)不定根的誘導(dǎo)反而不利。由表5還可知，僅添加IBA或NAA時(shí)，生根率及生根條數(shù)都極顯著低于添加NAA+IBA的組合。因此，最佳生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+0.4 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA+0.5 g·L-1AC+50 g·L-1土豆+50 g·L-1香蕉泥+20 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉膠。

表4 獨(dú)角石斛正交試驗(yàn)方差分析表Table 4 Variance analysis of D.unicorneum using orthogonal test

圖2 獨(dú)角石斛生根苗Figure 2 Rooting seedlings of D.unicorneum

表5 不同激素組合對(duì)獨(dú)角石斛生根的影響1)Table 5 Effects of different hormone combinations on the rooting of D.unicorneum

1)同列數(shù)值后附不同大小寫字母者分別表示差異達(dá)0.01、0.05顯著水平。

2.4 基質(zhì)對(duì)獨(dú)角石斛移栽成活率的影響

1)同列數(shù)值后附不同大小寫字母者分別表示差異達(dá)0.01、0.05顯著水平。

從表6可見，不同基質(zhì)對(duì)獨(dú)角石斛組培苗的移栽成活率有顯著影響。以水苔作為基質(zhì)時(shí)，成活率(90.5%)最高且莖粗壯、葉色深綠，苗長(zhǎng)勢(shì)好(圖3)；以水苔∶樹皮屑為1∶1作為基質(zhì)時(shí)，成活率較低；以樹皮屑為基質(zhì)，成活率最低且長(zhǎng)勢(shì)較弱。因此，選擇水苔作為獨(dú)角石斛的移栽基質(zhì)。

圖3 移栽45 d的獨(dú)角石斛組培苗Figure 3 Seedlings of D.unicorneum transplanted for 45 d

3 小結(jié)

目前獨(dú)角石斛尚未在市場(chǎng)上大量銷售，關(guān)于其組培技術(shù)的報(bào)道較少。本試驗(yàn)以獨(dú)角石斛側(cè)芽作為外植體誘導(dǎo)不定芽，篩選出了最佳繼代增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基及栽培基質(zhì)，以期為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為：MS+2.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂，誘導(dǎo)率最高，達(dá)95.5%；叢生芽的最適增殖培養(yǎng)基為：MS+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1KT+0.4 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂，增殖系數(shù)達(dá)4.78；最適生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+0.4 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA+0.5 g·L-1AC+50 g·L-1土豆+50 g·L-1香蕉泥+20 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉膠，生根率達(dá)100%，苗生長(zhǎng)健壯；組培苗經(jīng)15 d煉苗后，移栽到水苔基質(zhì)中，45 d后成活率達(dá)90.5%。

本研究表明，以MS為基本培養(yǎng)基適合石斛叢生芽的增殖繼代培養(yǎng)，這結(jié)果與蒙陽(yáng)等[12]研究相一致。為了提高獨(dú)角石斛移栽成活率，本試驗(yàn)通過在生根培養(yǎng)基中添加土豆、香蕉泥進(jìn)行邊生根邊壯苗，提高了組培苗移栽成活率，與高燕等[13]研究相一致。