二氧化硫預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注心律失常的作用

王新寶,崔 紅

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院兒科,北京 100050)

目前隨著導(dǎo)管技術(shù)、動脈旁路移植術(shù)、斷指再植和器官移植等新技術(shù)的開展，缺血組織在重新恢復(fù)血液循環(huán)再灌注后常有再灌注心律失常的發(fā)生，影響病情的發(fā)展及預(yù)后。其發(fā)病機(jī)制與再灌注后自由基生成增多有關(guān)，缺血再灌注后，黃嘌呤氧化酶形成增多、中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)及兒茶酚胺自氧化增強(qiáng)等均可引起氧自由基生成增加，可以與細(xì)胞中的多種成分發(fā)生反應(yīng)，如膜磷脂、蛋白質(zhì)和核酸等，造成了細(xì)胞自身的結(jié)構(gòu)破壞和功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，與此同時(shí)非自由基的過氧化氫和單線態(tài)氧可激發(fā)放出一個(gè)光子，引起細(xì)胞損傷。鈣超載、中性粒細(xì)胞的聚集活化、無復(fù)流現(xiàn)象和能量代謝障礙均促使缺血再灌注損傷的發(fā)生[1-2]。

近年來，研究表明氣體信號分子如一氧化氮、一氧化碳、硫化氫等在機(jī)體中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，另外一種氣體小分子二氧化硫(sulfur dioxide，SO2)是公認(rèn)的全球性大氣污染物，但在機(jī)體中SO2也可以內(nèi)源性產(chǎn)生，是L-半胱氨酸在不同酶作用下的代謝產(chǎn)物，SO2在體內(nèi)與水結(jié)合，以其衍生物——亞硫酸鹽和亞硫酸氫鹽(SO32-/HSO3-)的形式存在[3-4]。SO2預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注心律失常的作用尚不清楚，本研究通過給予SO2預(yù)處理，觀察SO2對大鼠心肌缺血再灌注后心律失常的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級雄性Wistar大鼠60只(動物合格證號：SCXK京2016-0011)，由北京友誼醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體重200～250 g,Na2SO3、NaHSO3均購自美國Sigma公司，使用前以0.9% NaCl注射液為溶劑，3∶1摩爾比新鮮配制成混合液，為SO2供體；其他試劑均為分析純，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。

1.2缺血再灌注心律失常模型制作方法及分組 使用20%烏拉坦(1 g/kg)腹腔注射，麻醉后背位固定，氣管插管，小動物呼吸機(jī)(Kent Scientific,USA)輔助呼吸，潮氣量2 mL/100 g，呼吸頻率60次/min，吸氣時(shí)間/呼氣時(shí)間比為1.5∶1，在大鼠胸骨左緣第4肋間剪開肋間肌，暴露心臟，在左心耳下緣約2 mm處，結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈(left coronary artery，LCA)，結(jié)扎時(shí)采用一塑料膠管墊于結(jié)扎線下，缺血30 min后松開結(jié)扎線，再灌注60 min[5]。

采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為4組:假手術(shù)組(Con組，n=15)，在冠狀動脈只穿線但不結(jié)扎血管；缺血再灌注組(I/R組，n=15)，結(jié)扎LCA 30 min后再松開結(jié)扎線(結(jié)扎線下墊橡皮墊)，使再灌注60 min；5 μmol/kg SO2組(I/R+S5組，n=15)，50 μmol/kg SO2組(I/R+S50組，n=15)分別用5 μmol/kg、50 μmol/kg SO2(Na2SO3/NaHSO3，用前以0.9% NaCl注射液為溶劑，3∶1摩爾比新鮮配制成混合液)在缺血前10 min從頸外靜脈注射(0.9% NaCl注射液溶解為1 mL)，然后結(jié)扎LCA 30 min，再灌注60 min。動物模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)過程中記錄 Ⅱ 導(dǎo)聯(lián)心電圖，結(jié)扎LCA時(shí)，心電圖ST段明顯抬高，結(jié)扎線下心肌組織顏色變白、缺血，松開結(jié)扎線后，心電圖ST段較結(jié)扎時(shí)降低，心肌組織顏色好轉(zhuǎn)。

1.3心電監(jiān)測 大鼠背位固定后，連接四肢電極，采用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連續(xù)心電監(jiān)測，以肢體Ⅱ?qū)?lián)作為標(biāo)準(zhǔn)，分析各心電參數(shù)，記錄結(jié)扎前、缺血和再灌注時(shí)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ導(dǎo)聯(lián)心電圖，觀察P波、QRS波ST段和T波變化，以及心律失常的發(fā)生情況，同時(shí)采用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)動態(tài)觀察大鼠心律以及平均動脈壓。

1.4氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取外周靜脈血，肝素抗凝，以離心半徑10 cm，3 000 r/min離心10 min后，留取上層血漿置于-80 ℃冰箱保存，進(jìn)行血漿中氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測，采用試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)測定血漿中SOD、丙二醛、GSH、GSH-Px水平。

SOD的測定通過黃嘌呤及其氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子，其可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜，測定560 nm處的吸光值，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算SOD的活性。丙二醛的測定根據(jù)試劑盒說明采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法，采用比色法同時(shí)測定532 nm和600 nm吸光值，利用兩者吸光度的差值計(jì)算丙二醛的含量。GSH的測定通過與2-硝基苯甲酸反應(yīng)產(chǎn)生2-硝基-5巰基苯甲酸，在412 nm處測定吸光度，利用分光光度計(jì)計(jì)算GSH的含量。GSH-Px的測定以過氧化氫為底物，通過比色法測定422 nm處吸光度值測定。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般情況和缺血再灌注過程中的心電圖表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)中各組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Con組和I/R+S5組無大鼠死亡，I/R組大鼠造模過程中死亡3只，I/R+S50組死亡2只，其余均造模成功。大鼠正常的心電圖表現(xiàn)見圖1a，結(jié)扎LCA后，可見Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段明顯抬高(圖1b)，再灌注后發(fā)生明顯室性心律失常(圖1c)，再灌注室性心律失常轉(zhuǎn)復(fù)后，抬高的ST段降低(圖1d)。

A：大鼠正常心電圖；B：心肌缺血后心電圖ST段明顯抬高；C：再灌注后發(fā)生心室纖顫的心電圖表現(xiàn)；D：心室纖顫轉(zhuǎn)復(fù)后的心電圖表現(xiàn)，ST段恢復(fù)正常

圖1 大鼠缺血再灌注心律失常的心電圖表現(xiàn)

2.2SO2對大鼠缺血再灌注心律失常的作用 Con組實(shí)驗(yàn)過程中沒有心律失常的發(fā)生，與I/R組相比，I/R+S5組再灌注過程中室性心律失常的出現(xiàn)時(shí)間顯著推遲，持續(xù)時(shí)間明顯縮短(P<0.01)，室性心律失常發(fā)生率明顯降低(P<0.01)，而I/R+S50組與I/R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 SO2對大鼠缺血再灌注心律失常的作用

I/R組：缺血再灌注組；I/R+S5組：I/R+SO2(5 μmol/kg)組；I/R+S50組：I/R+SO2(50 μmol/kg)組；a與I/R組比較，P<0.01

2.3SO2對大鼠氧化應(yīng)激的作用 與Con組相比，I/R組血漿抗氧化指標(biāo)SOD、GSH和GSH-Px水平均降低(P<0.01)，氧化產(chǎn)物丙二醛水平增高(P<0.01)。而I/R+S5組與I/R組相比，血漿中SOD、GSH和GSH-Px均明顯增高(P<0.01或P<0.05)，氧化產(chǎn)物丙二醛水平明顯降低(P<0.05)；I/R+S50組與I/R組各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

SOD(U/mL)(nmol/mL)GSH(mg/L)GSH-Px(U/mL)Con15138.4±8.56.5±0.710.2±2.3823.3±31.1I/R1288.5±10.8a11.4±1.3a4.3±0.7a442.3±36.2aI/R+S515149.6±16.9b7.2±1.3c9.6±1.0b786.6±50.0bI/R+S501388.5±8.112.1±1.411.3±1.4513.2±41.2F101.61214.485 8.01320.414P<0.001<0.001<0.001<0.001

SOD：超氧化物歧化酶；GSH：還原型谷胱甘肽；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶；Con組:假手術(shù)組;I/R組：缺血再灌注組；I/R+S5組：I/R+SO2(5 μmol/kg)組；I/R+S50組：I/R+SO2(50 μmol/kg)組；a與Con組比較P<0.01；b與I/R組比較，P<0.01，c與I/R組比較，P<0.05

3 討 論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)另外一種小分子氣體SO2也可以內(nèi)源性產(chǎn)生，并且具有舒張血管、降低血壓、調(diào)節(jié)心臟功能的重要作用，可以減輕肺動脈高壓，通過抑制肺動脈血管內(nèi)壁平滑肌細(xì)胞增殖、減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解改善血管重構(gòu)[3,6-10]；同時(shí)SO2可抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷，以及減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷[11]；SO2同時(shí)具有改善大鼠動脈粥樣硬化的作用，減少動脈粥樣硬化斑塊的形成[12]。在大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)，SO2預(yù)處理具有減少心肌梗死面積的作用，其機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激損傷和過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)[5]，上述結(jié)果表明SO2在機(jī)體中具有重要的生物學(xué)作用。

缺血再灌注損傷在臨床中較為常見，再灌注后的心律失常是常見的并發(fā)癥之一，發(fā)生率高達(dá)80%，包括室性心動過速和心室纖顫等嚴(yán)重的心律失常，是導(dǎo)致死亡的主要原因。其發(fā)病機(jī)制目前認(rèn)為與氧自由基的大量釋放、心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載、心肌電偶聯(lián)、ATP敏感性鉀通道的激活等有關(guān)，通過缺血預(yù)處理和后處理、抗氧自由基、鈣通道阻滯劑和β2腎上腺素受體阻滯劑可部分減少心律失常的發(fā)生，但仍缺乏有效的治療方法[13-14]。

本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注后心律失常的發(fā)生率高達(dá)83.3%，給予5 μmol/kg SO2預(yù)處理后室性心律失常的發(fā)生率明顯降低，同時(shí)室性心律失常的發(fā)生延遲，持續(xù)時(shí)間降低，而50 μmol/kg SO2預(yù)處理后無上述作用，上述結(jié)果表明小劑量SO2具有改善再灌注心律失常的作用。Wang等[5]前期研究表明5 μmol/kg SO2預(yù)處理具有減輕心肌缺血再灌注損傷的作用，可以減少心肌梗死面積，離體實(shí)驗(yàn)研究中表明SO2具有改善心臟功能的作用，其作用機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑有關(guān)，缺血前SO2可誘導(dǎo)適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕缺血后的再灌注損傷。但外源性的SO2暴露可使心率增快，特別是副交感神經(jīng)的心臟保護(hù)活動[15]。

自由基生成增多是缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一，氧自由基作用于膜上的不飽和脂肪酸，而且可進(jìn)一步產(chǎn)生脂質(zhì)自由基、脂質(zhì)過氧化物，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，造成細(xì)胞損傷[16-17]。本研究對再灌注后血漿中的氧化指標(biāo)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注大鼠血漿中抗氧化指標(biāo)SOD、GSH和GSH-Px水平明顯降低，氧化產(chǎn)物丙二醛水平明顯增高，給予5 μmol/kg SO2預(yù)處理后，血漿中SOD、GSH和GSH-Px水平明顯增高，氧化產(chǎn)物丙二醛水平明顯降低，而50 μmol/kg SO2預(yù)處理不具有上述作用。SO2改善心律失常的作用可能與減少氧自由基形成、抗氧化作用有關(guān)。但有研究表明吸入SO2(56和112 mg/m3)可使心肌組織中SOD活性降低，GSH-Px水平在雄性小鼠中降低，上述研究表明吸入SO2具有氧化損傷的作用，但該研究基于高濃度的SO2水平[18]。在油酸誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中，SO2可降低肺組織中氧自由基的生成，減少OH-和過氧化氫的生成，降低丙二醛的水平，增加GSH的水平，同時(shí)使SOD活性增高，上調(diào)肺組織中SOD1和SOD2的蛋白表達(dá)[19]，上述研究表明SO2在油酸誘導(dǎo)的急性肺損傷中具有抗氧化損傷的作用。在大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，SO2預(yù)處理可減輕缺血再灌注心肌梗死面積，上調(diào)心肌組織中SOD1和SOD2的蛋白表達(dá)，使組織中抗氧化酶的活性增高，同時(shí)可使心肌組織中H2S水平和胱硫醚-γ裂解酶活性增高，但降低一氧化氮水平和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶活性[20]，表明SO2減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷可能與其抗氧化作用有關(guān)，同時(shí)上調(diào)H2S/胱硫醚-γ裂解酶途徑和抑制一氧化氮/誘導(dǎo)型一氧化氮合酶途徑。鈣超載也是再灌注心律失常的發(fā)病機(jī)制之一，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞早期后除極，心肌細(xì)胞自律性改變，引起心律失常的發(fā)生，Zhang等[21]利用膜片鉗技術(shù)研究表明，SO2(50、100、500、1 000 μmol/L)可以通過抑制L型鈣通道減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流，該機(jī)制可能與SO2抑制再灌注后心律失常有關(guān)。

總之，SO2預(yù)處理可減輕大鼠心肌缺血再灌注后引起的心律失常，其機(jī)制可能與減少氧自由基的形成有關(guān)，SO2對心律失常的作用值得進(jìn)一步深入研究。