黑茶發(fā)酵過程中微生物多樣性研究進展

徐正剛， 吳 良， 劉石泉, 黃慧敏， 董 萌， 趙運林

(1. 湖南城市學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院黑茶金花湖南省重點實驗室， 益陽 413000；2. 中南林業(yè)科技大學(xué) 湖南省環(huán)境資源植物開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心， 長沙 410004)

中國是世界上最早發(fā)現(xiàn)和培育茶樹的國家, 茶葉種類很多，基本茶類分為6大類：綠茶、紅茶、烏龍茶、黃茶、白茶和黑茶[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，茶葉不僅可以作為飲品飲用，還有很多保健功效。茶葉中富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，如兒茶素、氨基酸、茶多酚、茶多糖等，這些物質(zhì)使得茶葉具有防氧化[2]、促消化、抗細菌感染、調(diào)節(jié)腸道微生物平衡、抗癌、防止心血管疾病、降脂減肥、殺菌消炎、利尿解毒、醒酒等諸多營養(yǎng)和保健功效[3-4]。

黑茶是6大茶類之一，屬于后發(fā)酵茶，生產(chǎn)歷史悠久，是我國特有的一大茶類[5]。按照原料和制作工藝的不同，可分為緊壓茶、花卷和散裝茶3類：緊壓茶主要有茯磚茶、青磚茶、六堡茶等；散裝茶有黑毛茶、普洱茶等；花卷主要是千兩茶等。

隨著方法和技術(shù)的進步，微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性研究在許多領(lǐng)域廣泛開展和應(yīng)用，但在黑茶發(fā)酵工藝中的研究沒有得到應(yīng)有的重視。對于黑茶中的優(yōu)勢菌分類地位一直存在爭議，以前受制于技術(shù)條件限制，科研工作者更多是通過微生物形態(tài)和生理生化特征等表型或者鏡檢圖片進行分類鑒定。由于各種黑茶產(chǎn)地、渥堆、發(fā)花工藝，檢測方法、時間季節(jié)的不同，分類鑒定結(jié)果不盡相同，甚至爭議很大，直到齊祖同以菌株有性型為模式命名的原則，將“金花菌”命名為冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)，才獲得了業(yè)界大部分人的承認[6]。黑茶作為一款獨特的微生物發(fā)酵茶，微生物對黑茶獨特品質(zhì)的形成勢必起到重要作用，但是大部分文獻報道中多是針對黑茶樣品中的優(yōu)勢菌株進行分離、鑒定，發(fā)酵條件和發(fā)酵產(chǎn)物方面研究，對于非優(yōu)勢菌及其發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)和動態(tài)變化研究卻不甚清楚，以整體思維統(tǒng)籌微生物在黑茶發(fā)酵過程中品質(zhì)變化的影響，對于優(yōu)化黑茶生產(chǎn)條件和工藝具有重要意義?；谏鲜觯覀兪占嚓P(guān)黑茶文獻，對黑茶發(fā)酵過程中微生物多樣性及群落變化情況進行綜述，探討微生物對黑茶風(fēng)味等品質(zhì)形成的影響，為黑茶中益生菌的有效利用和更好開發(fā)黑茶資源提供參考。

1 黑茶發(fā)酵工藝與微生物

黑茶發(fā)酵與微生物存在密切的聯(lián)系，在黑茶加工發(fā)酵儲存過程中都有微生物參與，微生物分泌多種胞外酶進行酶促反應(yīng)，水解轉(zhuǎn)化多種有機物質(zhì)，微生物作用形成了黑茶獨特的風(fēng)味特征(圖1)。微生物遍布黑茶加工的各個工藝階段，渥堆處理是黑茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵步驟，渥堆的實質(zhì)是茶原料在一系列微生物的作用下，經(jīng)過酶促反應(yīng)和發(fā)酵過程，形成葉色黑潤、香氣純正的品質(zhì)特征過程[8]。

圖 1 黑茶渥堆作用示意圖

張亞等認為渥堆的實質(zhì)是濕熱環(huán)境、微生物作用和酶促反應(yīng)三者綜合作用的結(jié)果[8]。黑茶因此被認為是中國最特殊的一類微生物發(fā)酵茶。

黑茶發(fā)酵各個階段過程中的優(yōu)勢菌不盡相同，優(yōu)勢菌和非優(yōu)勢菌共同組成了某一階段中特有的微生物群落結(jié)構(gòu)，對發(fā)酵進程起著各自不同的功能和作用，也使不同的階段呈現(xiàn)不同的特點[9]。酵母菌、霉菌和細菌是黑茶發(fā)酵過程中的主要微生物群落，溫瓊英等研究表明，渥堆可分為渥堆前期和后期，黑茶渥堆過程中優(yōu)勢微生物種群是假絲酵母屬(Candidaspp.)中的種群，黑曲霉(Aspergillusniger)、青霉屬(Penicillium)及少數(shù)霉菌，初期還有大量細菌，主要是無芽苞短桿菌(Bacillussubtilis)、芽孢細菌和球菌等[10]。對康磚茶的研究結(jié)果表明，細菌、霉菌、酵母依次在渥堆前期、中期、后期大量繁殖，由于渥堆環(huán)境的溫濕度以及微生物種群對營養(yǎng)物質(zhì)的需求不同，有的微生物適應(yīng)環(huán)境，有的則受到抑制，因此各種群繁殖的時期也不盡相同[11]。以上大量的研究均表明，黑茶渥堆過程中微生物的變化存在一定的規(guī)律。

各微生物優(yōu)勢菌在微生物發(fā)酵過程中起到的作用不盡相同。酵母菌含有非常豐富的酶系統(tǒng)，蛋白質(zhì)等有機物經(jīng)酵母菌發(fā)酵后生物活性會大幅提高，還能利用多種糖類代謝產(chǎn)生維生素B1、B2、C等[12]；根霉發(fā)酵能夠產(chǎn)生乳酸，有利于促進黑茶醇厚品質(zhì)口感形成。黑曲霉能分泌多種水解酶，通過影響氨基酸的含量影響黑茶口感；產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)代謝產(chǎn)生的青霉素對雜菌、腐敗菌可能有良好的抑制生長或消除作用[13]。冠突散囊菌產(chǎn)生各種胞外酶，抗氧化能力強，茶葉中各種大分子物質(zhì)通過胞外酶酶促反應(yīng)催化轉(zhuǎn)化為可供利用的生物小分子，如冠突散囊菌產(chǎn)生的紅冠突素和紫冠突素，經(jīng)多酚氧化酶作用將茶多酚分解為茶黃素、茶紅素乃至茶褐素，賦予了茶湯獨特的紅褐底色，提高茶葉風(fēng)味[14]。

眾多的研究表明，微生物與黑茶發(fā)酵過程密切相關(guān)，微生物的參與在黑茶發(fā)酵過程中起到了決定性的作用，在多種微生物菌株的作用下，成品黑茶茶湯具有獨特的醇厚口感，并且還具有多種對人體有益的成分，引起國內(nèi)外專家的廣泛關(guān)注，黑茶也成為追求健康人士喜愛的產(chǎn)品。因此，加強黑茶發(fā)酵過程中微生物多樣性研究，了解黑茶品質(zhì)變化過程顯得十分必要。

2 黑茶發(fā)酵與細菌多樣性

黑茶發(fā)酵最重要的渥堆過程中，先后出現(xiàn)的微生物類群有細菌，以球菌和芽孢桿菌(bacillaceae)為主、真菌多為青霉、黑曲霉和酵母菌。隨著渥堆時間的延長在種群和數(shù)量上不斷發(fā)生變化[10]。

細菌是喜濕性不耐高溫微生物，在渥堆前期，茶原料揉捻葉的含水量比較高，渥堆堆溫也接近常溫，這一條件剛好滿足細菌類喜濕的要求，使之得以大量繁殖，是初期微生物群落的主要優(yōu)勢菌群。細菌數(shù)量驟增后，其呼吸強度加大，渥堆葉溫迅速升高，同時，通過細菌的水解作用，為霉菌的生長累積了豐富的呼吸基質(zhì)。當(dāng)溫度升高后，細菌由于耐溫性較差，繁殖速度下降，數(shù)量呈現(xiàn)穩(wěn)中有降的趨勢。細菌前期的生理活動給以黑曲霉為主的喜溫喜濕的霉菌創(chuàng)造了有利的生長發(fā)育條件。

細菌在初期生長階段生長所需的碳源和氮源物質(zhì)，主要靠分解茶原料中的水溶性物質(zhì)如水溶性糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸和一些有機質(zhì)獲得[15-16]。對于水溶性糖類的利用方面，細菌只能將單糖消化分解釋放出能量，而對雙糖和多糖的利用最終還是要轉(zhuǎn)變?yōu)閱翁遣拍芙到猓毦ㄟ^水解酶或者磷酸化酶將雙糖分解為單糖[17]。細菌通過酶將蛋白質(zhì)分解成氨基酸，主要通過脫羧、脫氨和轉(zhuǎn)氨3種方式分解氨基酸，細菌分解氨基酸的能力較弱，氨基酸并不是細菌微生物獲得營養(yǎng)物質(zhì)的首要來源，獲取營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源是以糖類和一些水溶性的有機質(zhì)為主。但是由于細菌體內(nèi)的許多與生命相關(guān)的蛋白質(zhì)都是由氨基酸組成的，所以有關(guān)氨基酸合成方面的生理生化作用是細菌生命周期中不可替代的環(huán)節(jié)。茶原料中的其他水溶性的有機物主要是芳香類物質(zhì)，細菌對芳香族化合物的分解是在有氧條件下生成環(huán)裂解產(chǎn)物進行，最終被分解成水和二氧化碳，并放出能量。

3 黑茶發(fā)酵與真菌多樣性

真菌在黑茶發(fā)酵中的優(yōu)勢菌以霉菌和酵母為主，通常在中后期繁殖迅速，數(shù)量呈現(xiàn)穩(wěn)定增加的趨勢[18]。曲霉菌(Aspergillus)和青霉菌(Penicillium)在多種黑茶中都有發(fā)現(xiàn)，存在于黑茶加工的各個環(huán)節(jié)，是黑茶生產(chǎn)加工中不可或缺的重要微生物(表1)。胥偉等的研究表明散囊菌屬、青霉屬和曲霉屬是微生物中的優(yōu)勢群落[19]，青霉在渥堆過程中能夠水解茶葉中的纖維，增加糖類的含量，有助于形成黑茶醇和的口感。黑曲霉和酵母菌被證明是普洱茶中的優(yōu)勢菌，黑曲霉在渥堆時作為優(yōu)勢菌種，產(chǎn)生多種水解酶參與茶葉中各種物質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其次是酵母菌。

表 1 黑茶中真菌的發(fā)生情況

冠突散囊菌是茯磚茶中的優(yōu)勢益生菌，溫瓊英在以淀粉、單寧、葡萄糖為碳源的瓊脂培養(yǎng)基上接種冠突散囊菌，成功證明該菌能分解轉(zhuǎn)化淀粉和單寧物質(zhì)，降低茶葉的苦澀味，使茶葉滋味醇厚[25]。胡治遠等對不同地區(qū)具有代表性的茯磚茶樣品中的冠突散囊菌進行比較和鑒定，為冠突散囊菌多樣性鑒定與不同生理小種的命名提供了基礎(chǔ)[26]。

酵母菌是耐高溫干燥真菌，與喜好常溫濕潤環(huán)境的霉菌和細菌相反，在渥堆中后期，由于堆溫上升，酸度濕度改變，酵母菌數(shù)量開始占據(jù)主導(dǎo)地位，渥堆溫度的變化極大改變了發(fā)酵微生物的群落組成和多樣性狀況，對黑茶品質(zhì)的形成有重要影響。酵母菌通過酶促反應(yīng)能夠增加茶多酚、兒茶素和茶黃素等風(fēng)味物質(zhì)的含量，對黑茶香氣濃郁醇和等品質(zhì)特點形成，對各種功能性成分具有重要的調(diào)控作用[12]。

綜上所述，在黑茶渥堆過程中，細菌、霉菌和酵母菌均起著非常重要的作用，而且不同種類微生物的更迭是其內(nèi)部相互作用和自身代謝的必然結(jié)果。

4 黑茶與其他發(fā)酵茶微生物多樣性

黑茶的產(chǎn)區(qū)分布十分廣泛，各類黑茶制備工藝不盡相同，殺青、揉捻、渥堆、干燥是黑茶初加工過程中的必要工序(表2)。各類黑茶制備工藝中參與的微生物種類也不相同，但各類微生物都在某個進程中發(fā)揮特有的作用，對黑茶獨特品質(zhì)的形成發(fā)揮重要功效。

表2 各主要黑茶品種加工工藝

普洱茶渥堆過程中的優(yōu)勢菌種是以曲霉為主的霉菌和以產(chǎn)生酒精和產(chǎn)酯等生香酵母(Aromayeast)為主的酵母菌[20]，黑曲霉能水解蛋白質(zhì)，通過改變氨基酸含量從而影響普洱茶的風(fēng)味和品質(zhì)，酵母菌在普洱茶加工發(fā)酵中的數(shù)量巨大，在普洱茶渥堆發(fā)酵的過程中對普洱茶的品質(zhì)形成有重要作用，能夠增加茶多酚和氨基酸的含量，減少黃酮、兒茶素和茶紅素等降低茶品質(zhì)的物質(zhì)含量。

茯磚茶是所有黑茶品種中制備工藝流程最復(fù)雜的一種，在渥堆中主要參與的微生物有冠突散囊菌屬(Crytospora)、散囊菌屬、黑曲霉、毛霉(Mucoraceae)、青霉屬、謝瓦氏曲霉(AspergillusSheva)、冠突曲霉(Aspergilluscristatus)[27]等。發(fā)花工藝是茯磚茶區(qū)別其他黑茶品質(zhì)的關(guān)鍵工藝，起關(guān)鍵作用的是冠突散囊菌等散囊菌屬真菌，冠突散囊菌等優(yōu)勢益生菌對黑茶獨有菌花香的形成具有重要作用。

六堡茶渥堆過程中主要微生物有青霉、灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、黑曲霉、黃曲霉(Aspergillusflavus)，在后發(fā)酵階段也有少量金黃色散囊菌(GoldenSphaeroides)出現(xiàn)[23]，六堡茶獨特風(fēng)味的形成主要是通過霉菌實現(xiàn)的，其中曲霉、青霉在其中有促進變色作用，發(fā)酵后期出現(xiàn)的少量金黃色散囊菌能產(chǎn)生淀粉酶、氧化酶，對酶促反應(yīng)進程具有一定影響。四川康磚茶中的細菌優(yōu)勢菌為葡萄球菌屬(Staphyloccus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)；假絲酵母屬為酵母菌中的主要優(yōu)勢菌；霉菌優(yōu)勢菌則依次為黑曲霉屬、青霉屬、灰綠霉屬、毛霉屬，康磚茶中還發(fā)現(xiàn)了放線菌屬(Actinomyces)以及耐高溫的葡萄球菌屬微生物[19]。

5 微生物對黑茶風(fēng)味等品質(zhì)的影響

黑茶生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)都有微生物參與，渥堆微生物對黑茶風(fēng)味品質(zhì)有重要影響，茯磚茶中的優(yōu)勢益生菌冠突散囊菌，在磚茶中生長，產(chǎn)生胞外酶和金花，同時能分解淀粉和單寧等物質(zhì)，轉(zhuǎn)化各種有機物質(zhì)降低茶的苦澀味，使茯磚茶滋味醇厚，湯色紅亮。黑茶中的香氣部分來自微生物和其產(chǎn)生的胞外酶，在渥堆發(fā)酵過程中對底物作用產(chǎn)生的風(fēng)味香氣。曲霉分泌的銅酶絡(luò)氨酸酶等胞外酶可以形成生物堿和激素，增加茶堆中苦味的嘌呤堿含量，和兒茶素苦澀味的減少，給黑茶的風(fēng)味和滋味品質(zhì)帶來了巨大的影響[28]。細菌和真菌的存在，降解了粗纖維，導(dǎo)致了茶色褐黑，滋味變醇和，但細菌數(shù)量過多反而會影響黑茶的品質(zhì)。根霉能夠產(chǎn)生乳酸，有利于促進黑茶醇厚品質(zhì)口感形成。黑曲霉能分泌多種水解酶，通過影響氨基酸的含量影響黑茶口感。微生物分離培養(yǎng)結(jié)合氣相色譜、分光光度法、質(zhì)譜法等多種方法應(yīng)用于黑茶色澤、香氣、滋味等風(fēng)味研究，使對黑茶品質(zhì)形成的研究更加深入。

6 展望

黑茶作為中國最特殊的一類微生物發(fā)酵茶，由于獨特的口感和多種保健功效，受到民眾歡迎和追捧。結(jié)合現(xiàn)有文獻資料，對黑茶今后發(fā)展提出了幾點展望：1)從黑茶優(yōu)勢菌“金花菌”發(fā)現(xiàn)至今，對其分類地位一直存在爭議，借助現(xiàn)代分子技術(shù)和手段，明確其分類地位和種系發(fā)生，同時加大對非優(yōu)勢菌的研究，加強優(yōu)勢菌與非優(yōu)勢菌組合研究，對于改良黑茶加工工藝，縮短發(fā)花和渥堆時間均有借鑒意義。2)微生物的生長發(fā)育和類群演替受環(huán)境條件因子的影響較大。渥堆葉含水量很大程度上決定了微生物的繁殖速度及菌群分布，進而影響葉溫和酸度的變化，因此加強黑茶渥堆機械化控制技術(shù)的研究將是黑茶研究的一大趨勢。3)黑茶由于是一類較為特殊的微生物發(fā)酵茶，除通常的營養(yǎng)價值外，還具有一些突出的保健功能，黑茶市場因此變得更加廣泛，除早年產(chǎn)黑茶可以作為藏品進入收藏市場，黑茶原料經(jīng)不同微生物發(fā)酵后進行深加工可制成發(fā)酵食品如減肥茶和面膜等日用品，添加優(yōu)勢菌菌懸液進行液體發(fā)酵快速生產(chǎn)有助于提高產(chǎn)量，加強黑茶深加工研究也是今后研究的一大熱點。4)從國際最大茶葉品牌，立頓紅茶的發(fā)展經(jīng)驗來看，堅持品質(zhì)、確保穩(wěn)定的質(zhì)量標(biāo)準，按照統(tǒng)一的生產(chǎn)標(biāo)準，將不同產(chǎn)地不同品種的黑茶種類按照統(tǒng)一標(biāo)準生產(chǎn)制造、聯(lián)合銷售，形成國際知名的大品牌，改善現(xiàn)在茶葉地域各自為戰(zhàn)，產(chǎn)量小，地域性強，小作坊式生產(chǎn)格局，對于當(dāng)前破解全國黑茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展困局也有借鑒意義。