冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白的調(diào)控與功能研究進(jìn)展

王曉慧， 徐孝娜， 秦緒軍， 王 楓

(第四軍醫(yī)大學(xué) 軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室, 西安 710032)

體溫下降對細(xì)胞的直接影響是整體蛋白質(zhì)的合成受到抑制，從而使細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫S持生存的狀態(tài)。與大多數(shù)蛋白合成降低相反，一小部分蛋白，如冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白[Cirbp/CIRP，異質(zhì)核糖核蛋白A18(hnRNP A18)]，表達(dá)增加[1-2]。Cirbp屬于富含甘氨酸蛋白(GRP)家族，N′端有一個保守的RNA識別基序(RRM)，含有兩個核糖核蛋白(RNP)域：RNP1和RNP2[3]，C’端包含一個富含甘氨酸(RGG)結(jié)構(gòu)域。Cirbp是應(yīng)激應(yīng)答基因，它們的表達(dá)在多種應(yīng)激情況下均可誘導(dǎo)，包括低溫和高溫、低氧、輻射、藥物等。

Cirbp是早期發(fā)育的關(guān)鍵因子。在兩棲類，被廣泛用于發(fā)育研究模型，Xenopuslaevis(非洲爪蟾)同源xCIRP-1在發(fā)育中的腎臟和腦中瞬時表達(dá)，對胚胎腎形成至關(guān)重要[4]。Cirbp的同系物AxRBP在墨西哥蠑螈的表達(dá)在原腸期10～12 d開始，在神經(jīng)胚期15 d尤其是在神經(jīng)板和神經(jīng)褶達(dá)到峰值，孵化后下降到低水平[5]。在人類，Cirbp在甲狀腺和心臟呈高表達(dá)[6]。大鼠慢性間歇性冷暴露能引起代謝相關(guān)組織腦、心肌組織、骨骼肌和肝組織中Cirbp表達(dá)上調(diào)[7]。在亞細(xì)胞水平，Cirbp主要分布在細(xì)胞核中，參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄或結(jié)合mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在生理或應(yīng)激的情況下，Cirbp會在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭[8]。在哺乳動物中，細(xì)胞質(zhì)應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激時，Cirbp RGG結(jié)構(gòu)域精氨酸殘基的甲基化會引起Cirbp在細(xì)胞質(zhì)應(yīng)激顆粒中蓄積，而同應(yīng)力顆粒TIA-1的形成無關(guān)[9]。

臨床上，治療性低溫(32℃～34℃)已被證明是緩解缺氧缺血性腦病和成人急性腦損傷患兒神經(jīng)功能缺損的有力工具，而Cirbp蛋白質(zhì)的合成在溫和到中度低溫(32℃～34℃)時達(dá)到高峰[10]，因此Cirbp是很有前途的研究方向。

1 Cirbp的分子調(diào)控

目前，盡管已經(jīng)提出了一些涉及不同調(diào)控水平的模型，但低溫和其他應(yīng)激調(diào)節(jié)冷誘導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯的確切機(jī)制尚不清楚。在轉(zhuǎn)錄水平上，小鼠Cirbp基因上的核心啟動子和啟動子在低溫時可被活化[11]。選擇性剪接是低溫應(yīng)激應(yīng)答的重要途徑之一，冬眠動物主要表達(dá)短的異構(gòu)體，具有完整的開放閱讀框(ORF)[2]。人工低溫可以部分促進(jìn)從長型異構(gòu)體向短功能亞型的轉(zhuǎn)變[2]。在小鼠成纖維細(xì)胞，Cirbp的5′-UTR和全長ORF存在于兩個轉(zhuǎn)錄體上，這兩個轉(zhuǎn)錄體在低溫條件下均可產(chǎn)生，Cirbp轉(zhuǎn)錄體的5′-UTR上包含一個內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，而在熱應(yīng)激條件下，亞型缺少5′-UTR和起始甲硫氨酸的編碼序列[12]。Cirbp可在DNA雙鏈斷裂(DSBs)修復(fù)早期聚集在損傷部位，同PARP-1作用從而調(diào)節(jié)DSB修復(fù)和基因組的穩(wěn)定性[13]。此外，轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控冷誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，同37℃相比，在32℃，大量的轉(zhuǎn)錄因子Sp1招募到Cirbp基因5′側(cè)翼區(qū)的溫和冷反應(yīng)元件(MCRE)，從而增加了Cirbp表達(dá)[14]?？偟膩碚f，Cirbp對多種應(yīng)激應(yīng)答下的表達(dá)改變存在多種機(jī)制，提示對各種外部和內(nèi)部的應(yīng)激存在廣泛適應(yīng)。

2 Cirbp對轉(zhuǎn)錄后和翻譯的調(diào)節(jié)

正如其他的RNA結(jié)合蛋白，Cirbp能夠結(jié)合RNAs，從而調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄后水平[15-16]。在紫外光的照射下，Cirbp結(jié)合到3′-UTR兩個應(yīng)激應(yīng)答轉(zhuǎn)錄體上，復(fù)制蛋白A(RPA)和硫氧還蛋白(TRX)，從而穩(wěn)定結(jié)合的mRNA表達(dá)和促進(jìn)其翻譯[17-18]。Cirbp的RRM結(jié)構(gòu)域和RGG結(jié)構(gòu)域通過eIF4G連接TRX轉(zhuǎn)錄體的 5′-和3′-UTRs，eIF4G是增強(qiáng)TRX翻譯的一個關(guān)鍵組成部分。除了3′-UTR，poly(A)尾是Cirbp介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的一個重要調(diào)控元件。Cirbp富含poly(A)位點(diǎn)且控制許多基因的多聚腺苷酸化，如晝夜節(jié)律基因等，poly(A)尾可以加強(qiáng)Cirbp同TRX3′-UTR的結(jié)合并增強(qiáng)其穩(wěn)定性[17-18]。

Cirbp在蛋白質(zhì)翻譯中的功能還不清楚。有一些證據(jù)表明Cirbp可能通過靶向調(diào)控元件內(nèi)部基因抑制基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。例如，APBP-1，Cirbp雞同源體，結(jié)合到蛋白聚糖基因順式元件上并抑制其表達(dá)[19]。相反，在建系的CHO細(xì)胞系，37℃過表達(dá)Cirbp提高重組干擾素γ蛋白的生成[20]。

3 生物學(xué)功能與疾病

3.1 腦部疾病

治療性低溫不僅能有效地減輕急性缺血和脊髓損傷(SCI)的原發(fā)性損傷及防止其繼發(fā)性損傷，而且能延緩慢性神經(jīng)變性疾病的進(jìn)展。Cirbp在腦缺血損傷中的作用仍有爭議。大鼠海馬缺血后3～6 h，CirbpmRNA表達(dá)降低，但在大腦皮層48 h仍保持不變[21]。然而，在相同的腦缺血模型，大鼠皮層腦缺血后24 hCirbpmRNA增加了約5倍，同缺血相反，低溫顯著誘導(dǎo)Cirbp表達(dá)，24 h約增加30倍，低溫缺血聯(lián)合暴露沒有累加效應(yīng)[22]。

ROS水平升高是腦缺血再灌注損傷中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的一個重要的不利因素。在PC12細(xì)胞中，已經(jīng)觀察到H2O2處理產(chǎn)生ROS后 Cirbp的表達(dá)下調(diào)，當(dāng)內(nèi)源性或人工過表達(dá)誘導(dǎo)Cirbp表達(dá)升高后，對H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有明顯抑制，表明Cirbp具有神經(jīng)保護(hù)作用[21, 23]。同胞內(nèi)的有益作用相反，Cirbp釋放進(jìn)入血液系統(tǒng)與有害的免疫應(yīng)答有關(guān)。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均顯示，腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的Cirbp同之后的Cirbp介導(dǎo)的TNF-α表達(dá)導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥反應(yīng)和引起神經(jīng)元損傷有關(guān)[24]。綜上所述，Cirbp在腦缺血再灌注損傷中具有雙重作用：一方面，只要Cirbp仍然在細(xì)胞內(nèi)定位，它可以保護(hù)神經(jīng)元免于凋亡；另一方面，一旦Cirbp釋放到胞外，會激活小膠質(zhì)細(xì)胞從而引起中樞炎癥反應(yīng)。

3.2 晝夜節(jié)律

Cirbp在小鼠視交叉上核(SCN)和大腦皮層的表達(dá)存在晝夜調(diào)節(jié)，Cirbp的表達(dá)6 pm達(dá)到峰值，3 am表達(dá)最低，變化具有光依賴性，且這種波動只發(fā)生在幼年和成年小鼠[25]。同哺乳動物一樣，光信號已被觀察到誘導(dǎo)兩棲動物腦Cirbp的表達(dá)[26]。2012年，Cirbp被確定為轉(zhuǎn)錄后修飾哺乳動物晝夜節(jié)律的基因，如 CLOCK基因[15]。

在哺乳動物中，SCN的中樞節(jié)律系統(tǒng)將體溫周期與環(huán)境光-暗周期和外周時鐘(如肝臟和胰腺)同步起來[27]。最近的一項(xiàng)研究表明Cirbp導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞對溫度敏感的振動，同哺乳動物體溫和外周組織的晝夜節(jié)律的輕微波動有關(guān)聯(lián)[28]。此外，由于肝臟和胰腺是必不可少的代謝器官，營養(yǎng)必然影響這些器官的外周節(jié)律，如生酮飲食和禁食，擾亂外周時鐘，誘導(dǎo)肝臟Cirbp表達(dá)[29]。因此，Cirbp被認(rèn)為是哺乳動物晝夜節(jié)律振蕩的一個組成部分，它不僅受體溫調(diào)節(jié)和環(huán)境改變應(yīng)答，如光照的細(xì)微改變，而且還控制下游節(jié)律基因的表達(dá)。

3.3 免疫應(yīng)答

模式識別受體(PRRs)是識別病原相關(guān)分子模式(PAMP)和損傷相關(guān)分子模式(DAMP)的原始的關(guān)鍵部件，在植物到哺乳動物具有高保守性[30-31]。2007年，首次發(fā)現(xiàn)植物低溫誘導(dǎo)蛋白——AtGRP7參與植物免疫調(diào)節(jié)，AtGRP7顯著提高PAMP觸發(fā)的免疫應(yīng)答，通過結(jié)合兩個PRRS(FLS2和EFR)的轉(zhuǎn)錄體和蛋白質(zhì)[32]。哺乳動物的冷誘導(dǎo)蛋白也參與了天然免疫應(yīng)答。2013年，Cirbp被認(rèn)定為一種新的炎癥介質(zhì)，在失血性休克和膿毒癥時從心臟和肝臟釋放入血，結(jié)合TLR4-MD2復(fù)合體(一類哺乳動物PRRS)，刺激TNF-α和HMGB1分泌從而觸發(fā)炎癥反應(yīng)[33]。相反，Cirbp的表達(dá)可被TNF-α或TGF-β抑制，提示存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)。低溫誘導(dǎo)的肝Cirbp表達(dá)通過減少ROS的產(chǎn)生保護(hù)肝細(xì)胞[34]，而當(dāng)進(jìn)行抗Cirbp抗體治療，可顯著降低炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝臟免于缺血再灌注損傷[35]。如今用ELISA法檢測外周血中Cirbp水平，探討Cirbp作為一種新的膿毒癥診斷標(biāo)志物的可能性。胞外Cirbp通過誘發(fā)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，然而，在炎癥的晚期，受損的細(xì)胞被炎癥消除，再生的細(xì)胞可以替代功能失調(diào)的細(xì)胞[36]，因此Cirbp介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能也有有利的方面。

3.4 癌癥

Cirbp被認(rèn)為是一種原癌基因，在增殖和惡性腫瘤細(xì)胞中參與細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞增殖，且在不同的癌癥中與正常組織表達(dá)有差異(表1)。在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)，Cirbp可控制ROS蓄積和癌癥干/祖細(xì)胞擴(kuò)增促進(jìn)癌癥發(fā)生，肝癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險與肝Cirbp表達(dá)呈正相關(guān)，抑制Cirbp可能至少在肝癌治療中具有治療價值[37]。在結(jié)直腸腫瘤，Cirbp通過刺激細(xì)胞因子TNF-α和IL-23參與腫瘤發(fā)生和慢性炎癥[38]。在垂體腺瘤，高Cirbp表達(dá)可能通過ERK1/2信號通路同腫瘤的增殖侵襲和復(fù)發(fā)密切相關(guān)[39]。在口腔鱗狀細(xì)胞癌，Cirbp與TLR4共表達(dá)且與短期生存率相關(guān)[40]。與正常子宮內(nèi)膜相比，子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜增生Cirbp表達(dá)缺失或明顯下降，表明Cirbp在正常組織增殖中發(fā)揮作用[41]。Cirbp增加細(xì)胞周期調(diào)控因子CyclinE1的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)化增殖和腫瘤進(jìn)展[42]?？傊絹碓蕉嗟呐R床研究表明，Cirbp與腫瘤預(yù)后差有關(guān)。

表1 Cirbp在癌癥中的作用

3.5 繁殖

1997年，Cirbp在哺乳動物的睪丸生殖細(xì)胞中首次被發(fā)現(xiàn)[43]。睪丸的生理溫度低于體溫，這有利于精子的發(fā)生。已經(jīng)提出了幾種機(jī)制來解釋Cirbp在精子和睪丸損傷中的保護(hù)作用。在轉(zhuǎn)錄后水平，提高陰囊溫度導(dǎo)致睪丸和附睪減少Cirbp表達(dá)和生精細(xì)胞凋亡增加[44-45]；減少生殖細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡防止睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后睪丸損害，Cirbp表達(dá)下調(diào)后，生殖細(xì)胞的p44/p42、p38和SAPK/JNK MAPK通路活化，從而損害精子的發(fā)生[46]，抑制促凋亡蛋白p53和Fas降低隱睪誘導(dǎo)的睪丸損傷[47]；Cirbp調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的關(guān)鍵通路或組件，如同 Dryk1b /Mirk相互作用促進(jìn)未分化的精原細(xì)胞的增殖[48]。

4 結(jié)論與展望

綜上所述，Cirbp除參與冷應(yīng)激時細(xì)胞的各種生理進(jìn)程外，在常溫下許多內(nèi)源性和環(huán)境應(yīng)激條件，如滲透壓改變、輻射、毒素藥物和生長因子等，也發(fā)揮重要作用。Cirbp在多種類型的細(xì)胞中存在，可以由各種不同的細(xì)胞應(yīng)激激活，在細(xì)胞中的作用取決于特定的細(xì)胞狀態(tài)，也就是其他應(yīng)激應(yīng)答分子的存在。本文通過闡明Cirbp的上游和下游的分子和細(xì)胞方面，全面總結(jié)了Cirbp的生物功能，并強(qiáng)調(diào)其同體內(nèi)各種生理和病理過程的關(guān)系。作為一個新的增殖相關(guān)蛋白，可通過抑制Cirbp的表達(dá)來使細(xì)胞的增殖受損并增加細(xì)胞對化療的敏感性，因此調(diào)節(jié)Cirbp的表達(dá)可應(yīng)用到多種類型癌癥的治療。人和雄性動物生殖細(xì)胞溫度升高后Cirbp表達(dá)水平降低，對睪丸Cirbp表達(dá)機(jī)理的探討將有助于闡明男性不育的分子機(jī)制。目前低溫保護(hù)已應(yīng)用于心臟外科、腦外科等，對心臟驟停和腦缺血-再灌注損傷的治療及預(yù)后有重要意義。對今后Cirbp治療意義的關(guān)鍵是能夠?qū)F(xiàn)有的關(guān)于Cirbp作用的知識，靶向直接其中一個或者兩個蛋白或它們參與的信號通路，從而應(yīng)用到具體的治療方法。