經(jīng)皮導管引導下胃左動脈栓塞術(shù)對單純性肥胖比格犬體質(zhì)量及Ghrelin蛋白、Leptin蛋白表達的影響研究

陳偉，朱帝文，紀衛(wèi)政，顧俊鵬，張海瀟，鮑應(yīng)軍，李文棟，任偉新

肥胖是21世紀全球面臨的最嚴峻公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一。據(jù)統(tǒng)計，2013年全球范圍內(nèi)兒童超重和肥胖患病率較1980年增長了47.1%［1］。既往研究表明，體質(zhì)量快速增加是由正能量失衡所致，當能量攝入超過能量消耗即出現(xiàn)正能量負荷累積及代謝紊亂，可能影響正能量平衡的行為稱為“能量平衡相關(guān)行為”［2-3］，而影響兒童和青少年“能量平衡相關(guān)行為”的最重要因素為過度食用能量密集食物、體力活動過少及久坐等。顧東風等［4］研究結(jié)果顯示，1990年歸因于低體力活動的總死亡人數(shù)為148.9萬，2013年為218.2萬。肥胖不僅導致心理障礙（如焦慮、抑郁）、生活質(zhì)量下降，還會引起離異、就業(yè)困難等嚴重社會問題，甚至給患者造成致命危害，因此控制體質(zhì)量、減輕肥胖繼發(fā)的嚴重并發(fā)癥是現(xiàn)代醫(yī)學面臨的重要挑戰(zhàn)。目前，輕度肥胖主要采用飲食干預、加強運動等方式［5］，重度肥胖〔體質(zhì)指數(shù)（BMI）＞30 kg/m2〕需手術(shù)治療［6］。近年來國外減重手術(shù)已取得明顯進展，經(jīng)典胃轉(zhuǎn)流術(shù)治療肥胖及肥胖所致糖尿病、高血壓的效果已得到臨床證實，但該手術(shù)存在很多潛在并發(fā)癥［6］。近期經(jīng)導管介入治療是肥胖領(lǐng)域的研究熱點。本研究旨在分析經(jīng)皮導管引導下胃左動脈栓塞術(shù)對單純性肥胖比格犬體質(zhì)量及Ghrelin蛋白、Leptin蛋白表達的影響，為單純性肥胖患者介入治療的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康成年雄性比格犬15只，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，體質(zhì)量9.1～11.5 kg〔成年雄性比格犬標準體質(zhì)量為（10.0±0.4）kg〕，年齡2歲，所有比格犬在標準單籠（1.0 m×1.0 m×1.0 m）飼養(yǎng)并給予自然光照周期，飲水不限。

1.2 主要試劑及儀器 聚乙烯醇顆粒（Cook公司生產(chǎn)），Leptin抗體（ABIN2776943，Antibodies公司生產(chǎn)），Ghrelin抗體（ABIN223665，Antibodies公司生產(chǎn)），M5 Mammalian Protein Extraction Kit哺乳動物蛋白抽提試劑盒（聚合酶生物科技有限公司生產(chǎn)），SDS-PAGE配膠試劑盒（北京索萊寶有限公司生產(chǎn)），6×蛋白上樣緩沖液（北京索萊寶有限公司生產(chǎn)）；數(shù)字減影血管造影機（美國GE公司生產(chǎn)），導管鞘、導管（Cordis公司生產(chǎn)），微導管（Boston公司生產(chǎn)），SDS-PAGE蛋白電泳儀（PAC1000，Bio-RAD），蛋白轉(zhuǎn)膜儀（Bio-RAD）。

1.3 分組及肥胖模型建立 本實驗于2018年5—9月完成。將15只比格犬隨機分為對照組（n=5）和肥胖組（n=10）。對照組比格犬進食普通飼料；肥胖組比格犬參照文獻［7］中的營養(yǎng)性肥胖動物造模方式，進食高脂飼料；兩組比格犬均由專門動物飼養(yǎng)員飼養(yǎng)，投食量450 kg/次，2次/d，飲水不限，每日出籠活動2 h，共飼養(yǎng)6周，對照組比格犬達到標準體質(zhì)量或低于標準體質(zhì)量30%為合格，肥胖組比格犬體質(zhì)量超過標準體質(zhì)量≥30%為肥胖模型建立成功。去除對照組和肥胖組內(nèi)體質(zhì)量最低和最高的比格犬各2只以縮小誤差，然后選取6只肥胖比格犬隨機分為肥胖栓塞組和肥胖非栓塞組，每組3只。剩余比格犬棄之不用。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學動物倫理委員會審核批準。

1.4 經(jīng)皮導管引導下胃左動脈栓塞術(shù)

1.4.1 股動脈插管 所有比格犬術(shù)前禁食水12 h，以預防圍術(shù)期相關(guān)嚴重并發(fā)癥發(fā)生。然后給予阿托品0.03mg/kg肌肉注射，10 min后給予速眠新0.05 ml/kg肌肉注射，氯胺酮7 mg/kg、安定0.3 mg/kg靜脈注射，麻醉完全起效后開始手術(shù)。選擇右側(cè)腹股溝至膝關(guān)節(jié)下區(qū)域并剃毛消毒鋪巾，所有操作嚴格遵循無菌原則。在左側(cè)膝關(guān)節(jié)上方5 cm處切開皮膚約2 cm，純化分離周圍組織，分離股動脈。

1.4.2 胃左動脈栓塞術(shù) 采用4 F常規(guī)造影導管選擇性插管腹腔動脈，采用3 F微導管超選擇性插管至胃左動脈，完成胃左動脈造影。對照組和肥胖非栓塞組比格犬經(jīng)導管給予0.9%氯化鈉溶液6 ml進行胃左動脈灌注；肥胖栓塞組比格犬經(jīng)導管給予聚乙烯醇顆粒行胃左動脈栓塞術(shù)，以胃底部染色區(qū)域可見聚乙烯醇在血管內(nèi)滯留為栓塞成功。術(shù)后拔出導管，結(jié)扎插管動脈近段，逐層縫合肌肉，筋膜層，最后縫合皮膚。術(shù)中給予青霉素40萬U靜脈滴注，預防感染；術(shù)后給予0.9%氯化鈉溶液2 000 ml靜脈滴注，預防脫水。然后將比格犬送回動物單籠飼養(yǎng)，并嚴密觀察生命特征及術(shù)區(qū)恢復情況，術(shù)后10 d拆線。

1.5 觀察指標

1.5.1 體質(zhì)量 測量并記錄各組比格犬經(jīng)皮導管引導下胃左動脈栓塞術(shù)前及術(shù)后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周空腹體質(zhì)量，計算體質(zhì)量變化百分比。

1.5.2 Ghrelin蛋白、Leptin蛋白 采用Western blot法檢測各組比格犬Ghrelin蛋白、Leptin蛋白表達情況，具體如下：經(jīng)皮導管引導下胃左動脈栓塞術(shù)后10周處死動物并取比格犬胃組織200 mg，加1 ml RIPA和10 μl PMSF（100 mM）進行裂解，12 000 r/min離心30 min（離心半徑6 cm），去上清。采用BCA試劑盒檢測總蛋白，加6×蛋白上樣緩沖液沸水浴10 min，電泳（80 V 30 min，100 V 40 min），PVDF轉(zhuǎn)膜（80 mA 2.5 h），封閉，一抗4 ℃孵育過夜（Ghrelin抗體1:500；Leptin抗體1:1 000），TBST洗膜5次，5 min/次；HRP標記的山羊抗兔二抗（1:10 000）孵育2 h，TBST洗膜5次，5 min/次，加入ECL化學發(fā)光試劑進行曝光。采用Image J圖象處理軟件掃描目的蛋白質(zhì)并分析目的條帶灰度值，并計算目的蛋白質(zhì)相對表達量，目的蛋白質(zhì)相對表達量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以（雙側(cè)）P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量變化百分比 對照組比格犬術(shù)后10周內(nèi)體質(zhì)量變化百分比為（1.28±0.07）%，肥胖栓塞組為（2.69±0.32）%，肥胖非栓塞組為（1.91±0.17）%。3組比格犬術(shù)后10周內(nèi)體質(zhì)量變化百分比比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=3.43，P＜0.05）；其中對照組和肥胖非栓塞組比格犬術(shù)后10周內(nèi)體質(zhì)量變化百分比低于肥胖栓塞組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。對照組術(shù)后10周內(nèi)體質(zhì)量變化百分比較平穩(wěn)，肥胖栓塞組呈先上升后下降趨勢，肥胖非栓塞組呈持續(xù)升高趨勢，見圖1。

2.2 Ghrelin蛋白、Leptin蛋白相對表達量 術(shù)后10周3組比格犬Ghrelin蛋白、Leptin 蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中對照組和肥胖非栓塞組比格犬Ghrelin蛋白、Leptin蛋白相對表達量高于肥胖栓塞組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1、圖2）。

3 討論

肥胖是多基因相關(guān)疾病［8］，且肥胖相關(guān)基因表達及功能與環(huán)境有關(guān)［9］。既往研究表明，肥胖與糖尿病、膽石癥、脂肪肝、心血管疾病、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征、腦梗死等一系列代謝疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［10］。近年來隨著肥胖發(fā)病率升高，診療需求亦隨之增加，減重手術(shù)已成為治療肥胖的首選方法；但減重手術(shù)成功率不僅依賴于減少胃容量或降低胃部吸收營養(yǎng)功能，還與神經(jīng)內(nèi)分泌變化密切相關(guān)［11］。胃腸道部分神經(jīng)內(nèi)分泌信號因子參與體質(zhì)量變化、能量消化及脂肪代謝［12］。

圖1 3組比格犬術(shù)后10周內(nèi)體質(zhì)量變化百分比變化趨勢Figure 1 Change trend of percent change of body weight within 10 weeks after operation in the three groups of beagle dogs

圖2 3組比格犬Ghrelin蛋白、Leptin蛋白電泳圖Figure 2 Electrophoretogram for Ghrelin protein and Leptin protein in three groups of beagle dogs

表1 3組比格犬術(shù)后10周Ghrelin蛋白、Leptin 蛋白相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of relative expression quantity of Ghrelin protein and Leptin protein in the three groups 10 weeks after operation

表1 3組比格犬術(shù)后10周Ghrelin蛋白、Leptin 蛋白相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of relative expression quantity of Ghrelin protein and Leptin protein in the three groups 10 weeks after operation

注：與肥胖栓塞組比較，aP＜0.05

組別 只數(shù) Ghrelin蛋白 Leptin蛋白對照組 3 1.26±0.82a 1.20±0.07a肥胖栓塞組 3 0.78±0.42 0.66±0.14肥胖非栓塞組 3 2.18±0.33a 2.15±0.23a F值 5.16 7.28 P 值 ＜0.05 ＜0.05

Ghrelin與食欲密切相關(guān)，又被稱為“饑餓素”。胃底是Ghrelin分泌最豐富的部位，胃左動脈發(fā)自腹腔動脈供應(yīng)胃底絕大部分血流，經(jīng)皮穿刺途徑可進行超選擇性插管，因此胃左動脈可作為抑制胃底功能和控制Ghrelin水平的靶血管［13］。Leptin主要由脂肪細胞分泌，其他組織如胃底、骨骼肌、肝臟和胎盤也可以分泌。禁食后Leptin水平降低是由饑餓誘導的下丘腦-垂體-性腺軸抑制及其他幾個神經(jīng)內(nèi)分泌軸功能異常所致［14］。既往研究表明，減重手術(shù)可降低血漿Leptin水平，血漿Ghrelin水平與BMI呈負相關(guān)［12］；肥胖人群Ghrelin水平較低［15］，提示Ghrelin、Leptin表達與體質(zhì)量有關(guān)。

既往研究表明，單純性肥胖者胃部容受性及順應(yīng)性增高，胃容量增加，這是導致飽腹感延遲、攝食量增加及伴有暴食癥患者發(fā)展為肥胖的主要機制之一［16］。當BMI＞40 kg/m2或＞30 kg/m2并伴有肥胖相關(guān)慢性疾病時，對運動、飲食及藥物等的治療效果欠佳，需行手術(shù)治療［3］，如胃轉(zhuǎn)流術(shù)（RYGB）、胃袖狀切除術(shù)及可調(diào)節(jié)捆扎帶胃減容術(shù)（gastroplasty）。YARDIMCI等［3］通過比較不同減重手術(shù)治療肥胖的臨床效果發(fā)現(xiàn)，胃左動脈栓塞術(shù)可有效抑制血漿Ghrelin水平，降低食欲并減少比格犬攝食量，進而減少皮下脂肪含量和體質(zhì)量。胃左動脈栓塞術(shù)是一種新型代謝手術(shù)方式，具有微創(chuàng)、療效確切、患者恢復快等優(yōu)勢。AREPALLY等［17］第1次在動物模型中實施經(jīng)導管胃左動脈栓塞術(shù)并發(fā)現(xiàn)術(shù)后Ghrelin水平明顯降低，故建議采用經(jīng)導管胃左動脈栓塞術(shù)治療肥胖；之后BAWUDUN等［18］研究表明，胃左動脈栓塞術(shù)可有效抑制比格犬血漿Ghrelin水平，減少皮下脂肪含量及肝臟脂肪含量，降低體質(zhì)量；UMEMURA等［19］研究表明，減重手術(shù)可降低機體Leptin水平。GUNN等［20］研究表明，采用胃左動脈栓塞術(shù)治療的消化道出血患者較其他動脈栓塞術(shù)患者體質(zhì)量降低約2倍，并發(fā)現(xiàn)胃左動脈栓塞術(shù)后3個月患者體質(zhì)量較原體質(zhì)量降低7.3%。本研究結(jié)果顯示，對照組和肥胖非栓塞組比格犬術(shù)后10周內(nèi)體質(zhì)量變化百分比低于肥胖栓塞組，術(shù)后10周Ghrelin蛋白、Leptin蛋白相對表達量高于肥胖栓塞組，與上述研究結(jié)果相一致，提示經(jīng)皮導管引導下胃左動脈栓塞術(shù)可有效降低單純性肥胖比格犬體質(zhì)量及Ghrelin蛋白、Leptin蛋白表達，分析其原因可能為Ghrelin和Leptin（消脂素）是傳遞外周饑餓和飽食信號的主要通路［21］，而抑制Ghrelin和Leptin表達可影響下丘腦能量平衡中樞對食欲的調(diào)節(jié)，進而減輕體質(zhì)量。目前，由美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準的一項評估胃左動脈栓塞術(shù)治療肥胖安全性及可行性的臨床試驗（GETLEAN）正在研究中［22］，初期結(jié)果顯示所有受試者有不同程度體質(zhì)量降低（11.8～22.7 kg），且無嚴重并發(fā)癥［23-24］。

綜上所述，經(jīng)皮導管引導下胃左動脈栓塞術(shù)可通過抑制Ghrelin蛋白、Leptin蛋白表達而影響單純性肥胖比格犬食欲，進而降低體質(zhì)量。經(jīng)皮導管引導下胃左動脈栓塞術(shù)作為一種微創(chuàng)手術(shù)方式，有望為肥胖的治療提供新的思路。但本研究為動物實驗，且動物數(shù)量較少，實驗周期較短，經(jīng)皮導管引導下胃左動脈栓塞術(shù)治療單純性肥胖的有效性及安全性仍需大量臨床試驗證據(jù)證實。

作者貢獻：朱帝文、任偉新進行文章的構(gòu)思與設(shè)計；朱帝文、紀衛(wèi)政進行研究的實施與可行性分析；陳偉、鮑應(yīng)軍、李文棟進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；張海瀟進行結(jié)果分析與解釋；陳偉負責撰寫論文；紀衛(wèi)政、顧俊鵬負責文章的質(zhì)量控制及審校；任偉新對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。