酶解-超聲輔助聯(lián)用提取塔爾米多糖

敬思群 張俊艷 王德萍

(韶關學院英東食品科學與工程學院1，韶關 512005) (新疆大學生命科學與技術學院2，烏魯木齊 830046)

塔爾米(PanicummiliaceumL.)是新疆哈薩克族人們喜愛的一種傳統(tǒng)食品，形狀類似于俗稱的小米, 色澤金黃、顆粒飽滿[1]，《本草綱目》中稱黏者為黍，不黏者為稷；民間又將黏者稱黍子(脫殼后俗稱為黃米)，不黏者稱糜子，塔爾米即屬于不黏的一類。新疆塔爾米主要分布在塔城、伊犁等地，具有超強的抗逆性，其優(yōu)良的耐干旱能力、較短的生長周期、較高的產(chǎn)量(畝產(chǎn)200 kg)。塔爾米蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)12%左右， 最高可達14%以上；淀粉質(zhì)量分數(shù)70%左右，糖分含量低，適合糖尿病患者食用，可降血脂、降血壓，營養(yǎng)價值高[2]。趙正梅等人研究發(fā)現(xiàn)塔爾米30%乙醇提取物的抗氧化性最強[3]，尚未見對其水提物的研究報道。

多糖傳統(tǒng)的提取方法為水提醇沉，具有能耗高、提取率低等缺點[4]，目前，關于多糖提取方法已有較多報道，有超聲輔助提取[5]、酶解提取[6]、超臨界流體提取[7]等。超聲破碎是利用超聲波振動傳遞能量，改變物質(zhì)組織結(jié)構(gòu)、狀態(tài)、功能或加速這些改變過程，從而提高多糖得率，縮短提取時間，降低提取液黏度[8，9]。酶解提取反應條件溫和，近年來已經(jīng)廣泛應用于天然藥用植物有效成分提取[10-11]，由于塔爾米淀粉含量高達70%以上，傳統(tǒng)的水提醇沉提取塔爾米多糖時，由于大量淀粉的糊化而使水提過濾困難，采用α-淀粉酶可以解決此問題。

由于超聲波所產(chǎn)生的的空化等特殊作用，可以將植物中所含化學成分快速高效地提取出來，通過單因素實驗和U10(106)均勻設計確定了超聲輔助提取塔爾米多糖的最適超聲參數(shù)；另一方面，鑒于塔爾米高的淀粉含量而影響多糖的提取效果，考察pH值、酶解溫度及酶解時間對多糖提取率和純度的影響，采用L9(34)正交實驗確定了酶解和超聲輔助聯(lián)用提取塔爾米多糖的最優(yōu)工藝。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

生塔爾米全粉:自制(磨粉，過60目篩)；α-淀粉酶、 1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·，純度>97%)、2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+·，純度>98%)、抗壞血酸(VC，純度>99.8%)；其他試劑均為分析純。

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；Anke TDL-5-A離心機；SIM真空冷凍干燥設備；512GD紫外-可見光分光光度計；RHA-1000A型中草藥粉碎機。

1.2 塔爾米多糖提取工藝流程

傳統(tǒng)水提醇沉提取塔爾米多糖工藝流程：

塔爾米→干燥→粉碎→加水混勻→熱水浸提→多次抽濾→脫蛋白→離心→濃縮→醇析→沉淀→洗滌→干燥→塔爾米粗多糖→含量測定

超聲提取塔爾米多糖工藝流程：

塔爾米→干燥→粉碎→加水混勻→超聲波處理→熱水浸提→多次抽濾→脫蛋白→離心→濃縮→醇析→沉淀→洗滌→干燥→塔爾米粗多糖→含量測定

酶解-超聲輔助聯(lián)用提取塔爾米多糖工藝流程：

塔爾米→干燥→粉碎→加水混勻→調(diào)pH值(6.5)→加酶→滅酶→超聲波處理→熱水浸提→多次抽濾→脫蛋白→離心→濃縮→醇析→沉淀→洗滌→干燥→塔爾米粗多糖→含量測定

操作要點：將塔爾米放入烘箱中干燥后磨成細粉，過60目篩，加水混勻調(diào)pH值至6.5，按液料比20 ∶1加入α-淀粉酶，酶解pH 6.5，在50 ℃水浴鍋中加熱30 min后在90 ℃下滅酶5 min，冷卻至室溫；然后以水做溶劑，采用超聲輔助提取(超聲溫度40 ℃，超聲時間20 min，超聲功率160 W，提取溫度90 ℃，回流提取時間3 h)，重復提取3次，合并上清液，上清液用Savege 法去蛋白，V( 三氯甲烷)∶V( 正丁醇)= 5 ∶ 1[12]，將除去蛋白的多糖溶液濃縮至 1 /3，濃縮后的溶液加入3倍體積的95%的乙醇進行醇沉[13]，沉淀用無水乙醇洗滌3次。將得到的多糖進行冷凍干燥并稱重。

1.3 多糖提取率、純度的計算

多糖提取得率=粗多糖樣品質(zhì)量/塔爾米質(zhì)量×100%

多糖純度=多糖質(zhì)量/粗多糖質(zhì)量×100%

1.4 超聲輔助提取塔爾米多糖單因素實驗

超聲時間對塔爾米多糖提取率的影響：料液比1 ∶20，在40 ℃、120 W條件下分別經(jīng)超聲處理10、15、20、25、30 min，然后回流提取(90 ℃)，提取時間2 h，以塔爾米多糖提取率為指標，確定最適超聲處理時間。

超聲溫度對塔爾米多糖提取率的影響：料液比1 ∶20，分別在溫度為30、40、50、60、70 ℃條件下超聲處理25 min(超聲功率為120 W)，然后回流提取2 h，以塔爾米多糖提取率為指標，確定最適超聲溫度。

超聲功率對塔爾米多糖提取率的影響：料液比1 ∶20，在60 ℃條件下分別經(jīng)60、80、100、120、160 W超聲處理25 min，然后回流提取2 h，以塔爾米多糖提取率為指標，確定最適超聲功率。

液料比對塔爾米多糖提取率的影響：料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，超聲處理(60 ℃、140 W)25 min，然后回流提取2 h，以塔爾米多糖提取率為指標，確定最適料液比。

水浴提取溫度對塔爾米多糖提取率的影響：料液比1∶20，超聲處理(60 ℃、140 W) 25 min，然后分別經(jīng)60、70、80、90、100 ℃水浴回流提取2 h，以塔爾米多糖提取率為指標，確定最適提取溫度。超聲溫度40 ℃，超聲時間20 min，超聲功率160 W，提取溫度90 ℃，提取時間3 h，液料比20∶1。

水浴提取時間對塔爾米多糖提取率的影響：料液比1∶20，超聲波處理(60 ℃，140 W) 25 min，然后分別經(jīng)90 ℃回流提取2、3、4、5、6 h，以塔爾米多糖提取率為指標，確定最適提取時間。

1.5 酶解-超聲輔助聯(lián)用提取塔爾米多糖最優(yōu)工藝的確定

以下實驗塔爾米粉皆先經(jīng)酶解，然后再采用超聲輔助提取的最優(yōu)工藝條件(液料比20∶1，超聲溫度40 ℃，超聲時間20 min，超聲功率160 W，提取溫度90 ℃，回流提取時間3 h)提取得到塔爾米多糖，以多糖提取率和純度為指標，考查pH值、酶解時間、酶解溫度對酶解-超聲輔助聯(lián)用提取工藝提取效果的影響。

1.5.1 單因素實驗

pH值對塔爾米多糖提取率和純度影響：塔爾米粉與α-淀粉酶比例為1∶0.1，料液比1∶20，室溫下攪拌充分接觸溶解，然后分別調(diào)節(jié)pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，恒溫水浴溫度為55 ℃，酶解30 min，再將其置于 90 ℃ 的水浴鍋中5 min使酶失活后，按超聲輔助提取的最優(yōu)工藝條件提取塔爾米多糖，以塔爾米多糖提取率和純度為指標，確定最適的酶解pH值。

酶解時間對塔爾米多糖提取率的影響：塔爾米粉與α-淀粉酶比例為1∶0.1，料液比1∶20，室溫下攪拌充分接觸溶解，然后調(diào)節(jié)pH值為6.5，恒溫水浴溫度為55 ℃，酶解時間分別為15、20、25、30、35 min，其余操作同上，確定最適的酶解時間。

酶解溫度對塔爾米多糖提取率的影響：塔爾米粉與α-淀粉酶比例為1∶0.1，料液比1∶20，室溫下攪拌充分接觸溶解，然后調(diào)節(jié)pH值為6.5，分別在50、55、60、65、70 ℃下恒溫水浴30 min進行酶解，其余操作同上。

1.5.2 L9(34)正交優(yōu)化實驗

在單因素實驗基礎上，選取影響塔爾米多糖提取效果各因素中有意義的水平做正交實驗，并進行方差分析，以確定最佳的酶解條件。采用 L9(34)正交實驗優(yōu)化酶解工藝，以pH值、酶解時間、酶解溫度作為3個考察因素，選取3個水平進行實驗。

1.6 塔爾米多糖抗氧化性分析

總抗氧化能力測定：參照Pulgarín[15]方法。吸取不同濃度樣液1 mL，加入磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和1% K3Fe(CN)6溶液各2.5 mL，混合后于50 ℃放置20 min，加入10%TCA溶液2.5 mL混勻，吸取2.5 mL，加入蒸餾水和0.1%FeCl3溶液各2.5 mL，混勻，室溫下靜置10 min，于700 nm處測定吸光度(A)，根據(jù)公式計算清除率。

WA=A-A0

式中：WA為總抗氧化能力；A為樣品吸光度；A0為空白對照。

清除DPPH·自由基能力測定：參照宋燁威等[16]的方法。用無水乙醇將DPPH·試劑配制成2×10-4mol/L的溶液。準確吸取樣品待測溶液、DPPH·溶液各2 mL，混勻后室溫下放置30 min，于波長517 nm處測定吸光度。按公式計算各待測樣品對DPPH·自由基的清除率。

式中：Ai為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH·乙醇混合液的吸光度；Aj為2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇混合液的吸光度；Ac為2 mL DPPH·溶液+2 mL無水乙醇混合液的吸光度。

ABTS·+自由基清除能力測定：參照Cano等人[17]的方法。將2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS·+) 用蒸餾水配制成7.4 mmol/L溶液。取0.2 mL溶液與0.2 mL 2.6 mmol/L K2S2O8溶液混合均勻，避光放置12～16 h后，稀釋40～50倍，用磷酸鹽緩沖液將ABTS·+溶液稀釋至吸光度為0.70±0.02得到工作液。將塔爾米多糖用95%乙醇稀釋為5個不同濃度溶液。取0.2 mL塔爾米多糖溶液加入1.9 mL ABTS·+工作液混勻，震蕩10 s，靜置6 min后，于波長734 nm處測定吸光度。按公式計算各待測樣品對ABTS·+自由基的清除率。以95%乙醇作為空白對照，測吸光度A0。

式中：A為樣品吸光度；A0為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取塔爾米多糖單因素實驗

由圖1可知，隨著超聲時間的延長塔爾米多糖提取率增大，在25 min達到最大值后變化不大，考慮到實際生產(chǎn)的效益，超聲時間選25 min較為合適；隨著超聲溫度的升高塔爾米多糖提取率增大，在60 ℃時達到最大值，隨后稍有下降。由于超聲過程中介質(zhì)吸收超聲波后，將其轉(zhuǎn)化成熱能，從而導致物料內(nèi)部溫度升高較快，對塔爾米多糖有一定的破壞作用。綜上得知，超聲溫度選60 ℃較為合適；可看出塔爾米多糖提取率在140 W時達到最大，隨后稍有下降。這是由于隨著超聲波功率的增強，所產(chǎn)生的空化作用和機械振動效應增強等，促使更多活性物質(zhì)釋放擴散到溶劑中，影響了塔爾米多糖的溶出。綜上得知，超聲功率選140 W較為合適；塔爾米多糖提取率隨著液料比的增大而增大，在液料比為1∶25時達到最高，隨后稍有下降。這可能是由于塔爾米多糖在溶液中具有一定的溶解度，在塔爾米多糖溶解達到飽和時，過量的塔爾米不再溶解，提取率不再提高。綜上得知，液料比選25∶1較為合適；塔爾米多糖提取率隨著提取溫度的升高而增大，在90 ℃時達到最大值，隨后稍有下降。可見較高的提取溫度有利于多糖的溶出，但過高的溫度會使粗多糖降解，反而不利于提高提取率。綜上得知，提取溫度選90 ℃較為合適；隨著提取時間的延長塔爾米多糖提取率增加，當提取時間超過3 h時，提取率隨著時間的延長緩慢下降。是因為塔爾米多糖充分溶出之后，再增加提取時間會導致溶液中的多糖降解，從而使提取率下降。純度也呈類似的變化，只是在F圖中顯示當時間為4h時時純度最大，考慮能耗問題，提取時間選3 h較為合適。

圖1 超聲輔助提取塔爾米多糖單因素實驗

2.2 超聲輔助提取塔爾米多糖均勻設計優(yōu)化實驗結(jié)果

超聲輔助法提取塔爾米多糖涉及的工藝參數(shù)較多，包括液料比、超聲溫度、超聲時間、超聲功率、提取溫度、提取時間六個因素，且每個因素水平范圍較大，故采用U10(106)均勻設計[14]實驗對其優(yōu)化。結(jié)果如表1所示。

表1 U10(106)均勻設計實驗結(jié)果表

表2 提取率模型回歸方程方差分析

注：a.預測變量： (常量)，液料比、提取溫度、提取時間、超聲時間、超聲功率；b. 因變量：提取率;*表示P<0.05，影響顯著。余同。

表3 提取率回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果

表4 純度模型回歸方程方差分析

表5 純度回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果

將實驗結(jié)果經(jīng)SPSS17.0軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行回歸分析，并對該模型進行顯著性檢驗，結(jié)果見表3、表5，分別得回歸方程：

Y(提取率)=-0.774+0.007X2+0.027X3-0.0027X4+0.103X5+0.038X6

Y(純度)=73.739-0.609X2+0.270X3+0.307X4-2.443X5+0.015X6

方程的應變量與全體自變量之間的回歸效果顯著，可用于對實驗進行分析和預測。根據(jù)實際經(jīng)驗和結(jié)果可得到最終工藝參數(shù)為：液料比20∶1，超聲溫度40 ℃，超聲時間20 min，超聲功率160 W，提取溫度90 ℃，回流提取時間3 h，塔爾米多糖提取率為2.68%，純度為48.22%。

2.3 酶解工藝對塔爾米多糖提取率的影響

在確定了超聲輔助提取塔爾米多糖工藝條件基礎上，考察溫度、pH值、時間等酶解工藝對塔爾米多糖提取的影響。采用L9(34)正交實驗優(yōu)化酶解工藝。

2.3.1 酶解-超聲輔助聯(lián)用提取塔爾米多糖單因素實驗

由圖2可知，在pH值為6.5處提取率和純度達最大值，此為該α-淀粉酶的最適pH值，低于或高于最適pH值，酶的活力都會下降，因此酶解最適pH值為6.5；隨著酶解時間延長塔爾米提取率增大，在30 min達到最大，隨后曲線下降，這說明在一定時間內(nèi)酶解反應最充分，使多糖提取率達到最大，之后沒有更多的酶解底物了，因而提取率下降，故最適酶解時間為30 min；隨著溫度的提高塔爾米多糖提取率增大，在55 ℃達到最大，隨后曲線下降。這表明溫度是酶解反應的影響條件之一，一定溫度下酶解反應最為充分，溫度過高或過低都會導致酶活性失活，故55 ℃為最適酶解溫度。

圖2 酶解-超聲輔助聯(lián)用提取塔爾米多糖單因素實驗

2.3.2 酶解-超聲輔助聯(lián)用提取塔爾米多糖正交優(yōu)化實驗

由表6知，以提取率為指標時，因素主次順序為A>B>C，由表7方差分析可知，A對塔爾米多糖提取率效果影響差異顯著(P<0.5)，根據(jù)方差分析可知，C的改變對結(jié)果幾乎沒有影響，酶解-超聲輔助聯(lián)用提取工藝的最優(yōu)組合為A1B2C2，即為酶解pH6.5，酶解時間30 min，酶解溫度50 ℃，超聲溫度40 ℃，超聲時間20 min，超聲功率160 W，提取溫度90 ℃，提取時間3 h，液料比20∶1。在此條件下，驗證實驗得，塔爾米多糖提取率為5.24%、純度為64.32%。而未采用酶解處理的塔爾米多糖提取率為2.68%、純度為48.22%，酶解處理顯著提高了塔爾米多糖的提取效果(提取率提高2.56%，純度提高16.1%)，這是由于塔爾米淀粉含量高達70%以上，若不酶解淀粉，則在水提多糖時由于淀粉的糊化作用而影響多糖的提取。

表6 正交優(yōu)化實驗結(jié)果表

表7 方差分析表

2.4 塔爾米提取物抗氧化活性

由圖3a可知，VC和塔爾米提取物的總抗氧化能力都隨著濃度的增大吸光度也逐漸增大，在0.2～1.0 mg/mL范圍，總抗氧化能力隨著濃度增加呈線性增長趨勢，總體來看塔爾米提取物的總抗氧化能力弱于VC的總抗氧化能力，其中其塔爾米多糖總抗氧化能力略低于李恃圻等[18]報道的薏苡多糖；由圖3b可知，塔爾米水提物、塔爾米醇提物及抗壞血酸對DPPH·清除能力分別是(8.037±0.017 71)、(0.624 2±0.038 8)、(0.015 74±0.033 85) mg/mL，且呈一定的量效關系。塔爾米多糖清除DPPH·自由基能力與小米[19]的清除能力相當(20%～60%)；塔爾米多糖、塔爾米醇提物、塔爾米提取物及維生素E對ABTS+·清除能力分別是(3.314±0.966 0)、(1.055±0.052 1)、(0.6430±0.039 1) mg/mL，且呈一定的量效關系。塔爾米多糖有一定的抗氧化能力。

注：塔爾米水提物為塔爾米多糖。圖3 塔爾米提取物抗氧化活性

3 結(jié)論

酶解-超聲輔助聯(lián)用提取塔爾米多糖的最優(yōu)工藝為：塔爾米粉與α-淀粉酶混合，料液比1∶20，于室溫下攪拌使其充分接觸溶解，調(diào)節(jié)pH值為6.5， 50 ℃下恒溫水浴30 min，再將其置于 90 ℃ 的水浴鍋中5 min使酶失活后，在超聲溫度40 ℃，超聲時間20 min，超聲功率160 W，提取溫度90 ℃，回流提取時間3 h，減壓濃縮，冷凍干燥。在此條件下，塔爾米多糖提取率為5.24%，純度為64.32%(而超聲輔助提取法的提取率為2.68%，純度為48.22%)，酶解工藝提高了多糖提取率；塔爾米多糖有一定的抗氧化活性。