稻谷糧堆儲藏過程中微生物區(qū)系演替規(guī)律研究

奚 萌 周建新 葛志文 戚馨月

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023)

稻谷居我國三大主糧之首，在糧食安全中占重要地位。稻谷儲藏期間，由于受到儲藏條件的影響，易發(fā)生微生物特別是霉菌活動而發(fā)生霉變，給儲藏安全構(gòu)成威脅。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織 FAO統(tǒng)計，全球大多數(shù)發(fā)展中國家每年由于霉菌和儲糧害蟲造成的糧食產(chǎn)后損失至少在 10%～15%[1]。

國內(nèi)外有關(guān)稻谷儲藏過程中微生物活動與品質(zhì)變化規(guī)律的研究已取得一定進展。田海娟等[2]的研究表明稻谷儲藏期間受溫濕度的影響會引起微生物活動加劇的現(xiàn)象，儲藏環(huán)境相對濕度超過80%，微生物活動顯著增加，相對濕度超過90%，稻谷品質(zhì)受到顯著影響，糧層對濕度擴散有顯著的阻擋作用。周建新等[3]通過模擬儲藏，表明儲藏水分和溫度越高，稻谷霉菌量增長越快，并且曲霉是優(yōu)勢霉菌；霉菌量在104CFU/g以下，稻谷處于安全儲藏狀態(tài)，達到105CFU/g時，稻谷開始霉變，其值變化與霉菌演替有顯著相關(guān)性。楊基漢等[4]研究了高濕條件下溫度對儲藏稻谷水分和脂肪酸值的影響，結(jié)果表明儲藏環(huán)境的溫度和時間對稻谷的水分和脂肪酸值有顯著性影響，85%高濕條件下，隨著儲藏溫度的升高和時間的延長，水分呈先上升、平穩(wěn)、后下降的趨勢，方差分析得出儲藏環(huán)境的溫度和時間對稻谷的水分有顯著影響。林鎮(zhèn)清等[5]的研究表明，在實倉中，稻谷水分隨儲藏時間延長而逐漸降低，且表層水分低于上層水分，糧堆內(nèi)部糧食水分變化較小。Laca等[6]研究了霉菌在谷物中的分布，表明霉菌主要分布在谷粒表層，通過去除谷物外殼可顯著減少微生物污染。Genkawa等[7]研究了不同含水量稻谷儲藏過程中脂肪酸值、發(fā)芽率和霉菌活動的變化，表明低水分稻谷無霉菌生長，其儲藏的效果同低溫儲藏一樣有效。上述的研究結(jié)果多基于實驗室模擬儲藏或?qū)崅}混樣得到的研究結(jié)果，但由于環(huán)境溫、濕度的變化，儲藏稻谷糧堆內(nèi)的水分轉(zhuǎn)移，從而使稻谷不同糧層霉菌活動不盡相同，防霉、控霉有一定的盲目性。本文研究了高大平房倉中稻谷糧堆不同層微生物在儲藏過程中的變化規(guī)律，為儲藏稻谷的精準防霉和控霉提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 稻谷樣品采集

中儲糧泰州倉儲有限責任公司，17號倉，高大平房倉，當?shù)禺a(chǎn)2016年粳稻谷，2016年12月成貨位，糧堆高7.3米。2017年5月26日第一次取樣，此后每3個月取樣一次，共取樣4次。采用三層五點取樣法，分別以距糧堆表面0.5 m，糧堆中央層及距地面0.5 m為上層，中層，下層。每層以距糧倉東南角、東北角、西南角、西北角1米處及中央點作取樣點。即全倉共15個取樣點，每點取樣200 g，無菌采樣袋密封取回，實驗室中低溫保存。每個取樣點各稱取50 g于無菌均質(zhì)袋中，分別做每層的混樣及全倉總混樣的檢測。

1.2 培養(yǎng)基

高鹽察氏瓊脂：北京陸橋技術(shù)責任有限公司；察氏瓊脂、平板計數(shù)瓊脂：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器與設備

LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器；101-3AS型電熱鼓風干燥箱；BSC-1300ⅡA2型生物安全柜；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱；ZQTY-70S型大容量低溫搖床；JE1001型電子天平；HH-M8型八孔水浴鍋；ZEISS Scope A1型正置熒光顯微鏡；ABI3730XL型基因測序儀。

1.4 指標及其測定方法

霉菌量：參照GB4789.15—2016，選用高鹽察氏瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)6d后觀察結(jié)果。用察氏瓊脂培養(yǎng)基平板進行霉菌分離與純化；采用形態(tài)特征[8-10]與分子生物學技術(shù)[11-12]相結(jié)合進行菌種鑒定。細菌量：參照GB4789.2—2016；水分測定：參照GB 5009.3—2016。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每次實驗設定3組平行，每組實驗重復3次。使用EXCEL對測定數(shù)據(jù)作圖， SPSS軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻谷糧堆儲藏過程中水分變化規(guī)律

稻谷儲藏過程中水分含量的變化情況如圖1所示，4次取樣時間分別對應稻谷初始儲藏，儲藏90，180，270 d。由圖可知，該倉稻谷水分含量在14.1%-14.5%之間，低于安全水分，稻谷糧堆下層及全倉混樣水分含量隨儲藏時間的延長呈下降趨勢。稻谷糧堆上層與中層水分含量隨儲藏時間的延長先降低后略微增加。以層次來看，相同儲藏時間內(nèi)，稻谷水分含量中層>下層>上層。由于儲藏過程中水分遷移及通風技術(shù)的影響，下層稻谷水分向中層與上層遷移，中層最易受影響，故中層稻谷水分含量最高，糧層對濕度擴散有顯著的阻擋作用[2]且上層稻谷受外界環(huán)境影響較大水分易揮發(fā)故水分含量最低[5]。

以儲藏時間和糧層位置兩因素作變異源，進一步對稻谷水分含量作方差分析，如表1所示，因素“糧層位置”F=1.745，自由度df1=3,df2=32,和顯著性水平α=0.05，查表得F0.05(3,32)=2.90。由于實得F>F0.05(3,32)表明不同糧層間稻谷水分含量有顯著差異。因素“儲藏時間”F=5.426由于實得F>F0.05(3,32)表明不同儲藏時間稻谷水分含量存在顯著性差異。糧層位置和儲藏時間的交互作用下稻谷水分含量有著性差異(P=0.000)。說明糧層位置與儲藏時間均對稻谷水分含量有顯著影響。

圖1 稻谷糧堆各層水分含量變化規(guī)律

F5.678E-631.893E-612.1320.0002.438E-538.127E-65.4260.004?7.233E-598.036E-75.1510.000e0.000321.560E-70.97448

2.2 稻谷糧堆儲藏過程中霉菌量演替規(guī)律

稻谷儲藏過程中霉菌量的演替情況如圖2所示，由圖可知，稻谷糧堆上層、中層、下層及全倉混樣霉菌量隨著儲藏時間的延長，呈先增加后逐漸減少的趨勢。從層次來看，在同一儲藏時間，稻谷霉菌量上層>中層>下層。

以儲藏時間和糧層兩因素作變異源，進一步對稻谷霉菌量作方差分析，如表2所示，因素“糧層位置”F=29.778，自由度df1=3，df2=32和顯著性水平α=0.01，查表得F0.01(3,32)=4.46。由于實得F>F0.01(3,32)，表明不同糧層間霉菌量有極顯著差異。因素“儲藏時間”F=147.039，由于實得F>F0.01(3,32)，表明不同儲藏時間稻谷霉菌量存在極顯著差異。糧層和儲藏時間的交互作用下稻谷糧堆霉菌量達到極顯著性差異(P=0.000)。說明稻谷糧堆的糧層位置與稻谷儲藏時間對霉菌量均有顯著性影響。

圖2 稻谷糧堆各層霉菌量演替規(guī)律

F 8 207 500.0003 2 735 833.33329.7780.0004.053E731.351E7147.0390.000?8 684 166.6679964 907.4110.5020.000e2 940 000.0003291 875.0005.130E848

2.3 稻谷糧堆儲藏過程中優(yōu)勢霉菌演替規(guī)律

2.3.1 優(yōu)勢霉菌的分離與鑒定

對培養(yǎng)出的各菌株編號，并分別計算各菌的百分比，列出優(yōu)勢菌。各菌種于察氏培養(yǎng)基中進行分離培養(yǎng)。觀察菌落形態(tài)和菌體特征，并以ITS1與ITS4作特征引物，提取基因組DNA，合成引物，擴增ITS區(qū)全序列，擴增結(jié)果如圖3所示。采用膠回收方法對PCR產(chǎn)物純化，使用基因測序儀進行測序，在GenBank數(shù)據(jù)庫中Blast測序結(jié)果。通過Blast對比結(jié)果并結(jié)合菌落形態(tài)與無性繁殖體特征，確定3株優(yōu)勢菌分別為黃曲霉、阿姆斯特丹曲霉、黑曲霉。

圖3 ITS區(qū)全序列擴增結(jié)果

2.3.2 稻谷糧堆儲藏過程中優(yōu)勢霉菌演替規(guī)律

稻谷儲藏過程中優(yōu)勢霉菌演替如表3所示。由表可知，儲藏開始時，全倉混樣、中層和下層優(yōu)勢霉菌均為阿姆斯特丹曲霉、黃曲霉和黑曲霉(按帶菌量所占百分比由高到低排列)，隨著儲藏時間的延長，阿姆斯特丹曲霉所占比例呈增加趨勢，黃曲霉所占比例呈下降趨勢，黑曲霉基本不變。上層優(yōu)勢霉菌分別為黃曲霉、阿姆斯特丹曲霉和黑曲霉(按比例由高到低排列)，但隨儲藏時間的延長，阿姆斯特丹曲霉逐漸取代黃曲霉成為最主要優(yōu)勢霉菌，黃曲霉與黑曲霉所占比例大致呈下降趨勢。儲藏結(jié)束時，各糧層的優(yōu)勢霉菌種類趨于相同，所占比例基本一致。

表3 稻谷糧堆儲藏過程中優(yōu)勢霉菌百分比變化(%)

2.4 稻谷儲藏過程中細菌量的演替規(guī)律

稻谷儲藏過程中細菌量的演替情況如圖4所示，由圖可知稻谷糧堆上層、下層及全倉混樣細菌量隨儲藏時間的延長呈逐漸減少趨勢。稻谷糧堆中層，細菌量隨儲藏時間延長呈先增加后逐漸減少趨勢。從層次來看，在同一儲藏時間，稻谷細菌量中層>下層>上層。

以儲藏時間和糧層位置兩因素作變異源，進一步對稻谷細菌量作方差分析，結(jié)果如表4所示，因素“糧層位置”F=16.304，自由度df1=3，df2=32，和顯著性水平α=0.01，查表得F0.01(3,32)=4.46。由于實得F>F0.01(3,32)，表明不同糧層間細菌量有極顯著差異。因素“儲藏時間”F=453.062，由于實得F>F0.01(3,32)，表明不同儲藏時間稻谷細菌量存在極顯著差異。糧層位置和取樣時間的交互作用下稻谷細菌量達到極顯著性差異(P=0.000)。說明表明稻谷糧堆的糧層位置與稻谷儲藏時間對細菌量均有顯著性影響。

圖4 稻谷糧堆各層細菌量演替規(guī)律

F1.351E834.503E716.3040.0003.754E931.251E9453.0620.000?1.410E891.567E75.6740.000e8.839E7322 762 083.331.023E1048

2.5 稻谷糧堆儲藏過程中微生物區(qū)系變化規(guī)律討論

圖5 稻谷糧堆各層均溫及倉溫變化圖

稻谷儲藏過程中各糧層糧溫及倉溫變化如圖5所示，稻谷糧堆上層糧溫與全倉糧溫均溫自初始儲藏至儲藏90天期間上升，后逐漸下降。中層與下層稻谷糧溫自初始儲藏至儲藏180天期間上升，儲藏180天至270天之間糧溫下降。由于稻谷糧堆上層易與外界空氣接觸，故糧溫與倉溫間差距較小。中層與下層難與外界空氣接觸，故糧溫存在滯后效應，在儲藏90天至180天之間，倉溫急劇下降，中層與下層稻谷糧溫反增。

霉菌與細菌的生長均需要充足水分與適宜溫度。稻谷的初始水分較低，處于安全水分以下，隨儲藏時間延長而有所下降，但變化率小。糧溫在儲藏過程中變化較明顯，故霉菌量受糧溫影響較大。初始儲藏至儲藏90天稻谷糧溫明顯升高，全倉均溫由12 ℃升至16.7 ℃，故各層霉菌量明顯增加，其后糧溫降低，霉菌量隨之減少。上層稻谷糧溫普遍高于其他糧層，所以上層稻谷霉菌量最多。隨儲藏時間延長，各層阿姆斯特丹曲霉比例增加，成為最主要的優(yōu)勢霉菌，黃曲霉比例降低，黑曲霉比例幾乎不變。由于阿姆斯特丹曲霉適宜在低水分環(huán)境繁殖，黃曲霉為中生性，黑曲霉為接近高溫、高濕的霉菌[9]，所以對阿姆斯特丹曲霉生長的影響遠小于對黃曲霉、黑曲霉生長的影響。細菌為濕生性微生物，對水分要求較高，故儲藏過程中稻谷細菌量受稻谷水分含量影響較大隨水分含量降低呈下降趨勢。中層稻谷水分含量最高，所以中層稻谷細菌量最多。

3 結(jié)論

稻谷的初始水分較低，儲藏期間水分含量為14.1%-14.5%,處于安全水分以下。隨儲藏時間的延長，稻谷糧堆各層水分逐步降低霉菌量先增加后減少，細菌量呈逐步減少的趨勢。儲藏同一時間，稻谷霉菌量上層>中層>下層，細菌量中層>下層>上層。進一步方差分析表明糧層位置與儲藏時間對霉菌量與細菌量均有顯著影響。由于稻谷水分含量變化率較小，霉菌受糧溫影響較大，故隨糧溫升高先增加后隨糧溫降低而減少。細菌為濕生性微生物，受稻谷水分含量影響較大，儲藏過程中稻谷水分含量降低，故細菌量減少。儲藏開始時，上層的最主要優(yōu)勢霉菌為黃曲霉，中、下層的最主要優(yōu)勢霉菌為阿姆斯特丹曲霉，隨儲藏時間的延長，各層的阿姆斯特丹曲霉比例增加，其比例超過40%，為最主要的優(yōu)勢霉菌,黃曲霉比例降至22%左右，黑曲霉比例幾乎不變約為17%。原因是阿姆斯特丹曲霉為干生性曲霉，而黃曲霉、黑曲霉屬于中生性或濕生性霉菌，對阿姆斯特丹曲霉生長的影響遠小于對黃曲霉、黑曲霉生長的影響。