基于超濾技術(shù)的苦蕎提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

李云龍 韓 林 王 敏

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所1，太原 030031) (西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2，楊凌 712100)

蕎麥(Fagopyrum tataricum)，又名三角麥、烏麥等，是一種蓼科蕎麥屬植物，主要栽種于北半球高寒地區(qū)[1]。世界上有15個蕎麥品種，目前，主要的種植品種為甜蕎和苦蕎，其中苦蕎由于含有更豐富的酚類等活性成分，近年來備受關(guān)注[2]?？嗍w(Fagopyrum tatarium Gaertn.)，也稱韃靼蕎麥，在我國主要種植于山西、陜西、貴州、云南、四川和內(nèi)蒙古等省區(qū)[3]?？嗍w中含有豐富的蛋白質(zhì)(13.15%)、淀粉(57.40%)和油脂(3.84%)等營養(yǎng)物質(zhì)，同時也含有大量的酚類物質(zhì)，苦興2號、迪慶苦蕎、西農(nóng)9940等不同品種及其不同部位(麩、殼、粉)中總酚的含量分別為5.15～9.66和0.98～9.31 g/100 g DW，其中以蘆丁和槲皮素等為主[4，5]。除了酚類物質(zhì)外，苦蕎中的其它活性成分如D-手性肌醇、D-蕎麥堿等近年來也逐步被深入研究[6，7]。

大量流行病學(xué)研究和動物實驗均表明，苦蕎具有多種生理功效，如降血糖、抗氧化、抗癌、抗炎、降血脂、降血壓等[8-9]。Skrabanja等[10-11]在人體實驗中發(fā)現(xiàn)食用含蕎麥50%的面包可降低餐后血糖和胰島素水平，而2型糖尿病患者食用蕎麥后2 h，其血糖水平與對照相比可下降51%(P<0.05)。伍楊等[12]利用四氧嘧啶造高血糖大鼠模型，飼喂含苦蕎的標準飼料6周后發(fā)現(xiàn)，大鼠空腹血糖水平顯著降低，血清TC和TG水平也較高脂飼料組明顯下降。α-葡萄糖苷酶是一種位于小腸刷狀細胞表面的碳水化合物消化酶。因此，抑制α-葡萄糖苷酶活性，可以降低餐后血糖水平。體外實驗表明，苦蕎提取物對α-葡萄糖苷酶活性具有顯著的抑制作用，深入研究發(fā)現(xiàn)提取物中的主要成分蘆丁、異槲皮素和槲皮素均具有良好的酶活抑制作用，其中槲皮素的效果比降血糖藥物阿卡波糖還要強[13，14]。然而，苦蕎提取物成分較為復(fù)雜，其中是否還有更多更有效的α-葡萄糖苷酶活性抑制成分尚未完全研究清楚。因此，本課題利用超濾技術(shù)，分離苦蕎中α-葡萄糖苷酶活性抑制成分，再利用HPLC進行分析，同時采用分子模擬對接技術(shù)初步研究了這些成分對α-葡萄糖苷酶抑制的作用機理，以期為深入開發(fā)和利用苦蕎資源提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎(Tartary buckwheat)，品種為西農(nóng)9940，來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)榆林小雜糧試驗示范站。

標準品蘆丁、槲皮素、肉桂酸、鞣花酸、對香豆酸(純度>98%):上海源葉生物技術(shù)有限公司；α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖:Sigma公司；無水乙醇、丙酮等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

merck millipore超濾管(10 kD)；LC-20高效液相色譜儀；RE52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；LGJ-25C真空冷凍干燥機；UV3100紫外-可見分光光度計；HC-2516高速離心機。

1.3 方法

1.3.1 不同溶劑苦蕎提取物的制備

將苦蕎種子粉碎后，過40目篩。準確稱取50 g苦蕎粉，分別加入200 mL水、80%乙醇(V/V)和30%丙酮(V/V)，40 ℃超聲(80 kHz)提取20 min，然后5 000 r/min離心10 min，收集上清液，殘渣再分別用溶劑提取2次，離心后收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后置于真空冷凍干燥機中干燥，-20 ℃保存，備用[15]。

1.3.2 不同溶劑苦蕎提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

取10 μL不同濃度(2～32 mg/mL)的苦蕎提取物，分別加入10 μL PBS(pH 8.6)和10 μL 0.5U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，混勻后于37℃孵育15 min，再加入20 μL 3 mmol/L的pNPG，再孵育10 min，加入150 μL 0.1 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)。利用酶標儀在405 nm處測定吸光度，分別設(shè)置空白組和對照組，同時以阿卡波糖作陽性對照[16]。提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用按公式計算：

抑制率=[1-(As-Ab)/Ac]×100%

式中：As為樣品組吸光值；Ab為空白組吸光值；Ac為對照組吸光值。

1.3.3 超濾實驗

將3種提取物溶解于10 mmol/L的乙酸銨緩沖液(pH=6.86)中，過0.45 μm濾膜，配制成2 mg/mL濃度的溶液，按圖1所示流程圖進行超濾實驗，具體操作為：分別取200 μL的樣品，加入200 μL 0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，置于搖床中37 ℃、500 r/min孵育30 min。將混合物轉(zhuǎn)移至超濾管中，10 000 r/min離心15min，加入100 μL乙酸銨緩沖液重復(fù)操作3次，除掉未結(jié)合的物質(zhì)。然后再加入100 μL pH 3.3的甲醇-水溶液(50∶50，V/V)，輕輕振搖超濾管，釋放與酶結(jié)合的物質(zhì)，10 000 r/min離心15min，再加入甲醇-水溶液重復(fù)操作3次，收集濾液，利用真空冷凍干燥機干燥后，加入200 μL甲醇-水溶液(50∶50，V/V，色譜純)復(fù)溶，備用[17-18]。

1.3.4 HPLC分析

HPLC分析條件：色譜柱為Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長254 nm；流動相A為pH 2.6的磷酸水，流動相B為色譜甲醇；洗脫條件：0～15 min 15%-25%的流動相B，15～25 min 25%-75%的流動相B，25～65 min 75%-15%的流動相B，流速為0.8 mL/min。根據(jù)樣品中活性成分與標品的保留時間進行定性[19]。

1.3.5 蘆丁和槲皮素對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

將蘆丁和槲皮素標準品配制成不同質(zhì)量濃度(12.5～150 μg/mL)的溶液，按1.3.2方法驗證其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

1.3.6 分子模擬對接

采用Sybyl-X 2.0軟件獲得蘆丁和槲皮素的分子結(jié)構(gòu)，并進行加氫和結(jié)構(gòu)優(yōu)化處理。從Protein Data Bank(PDB)獲取α-葡萄糖苷酶的3D結(jié)構(gòu)(PDB ID：3A4A；gi number:411229),并進行去水分子、去電荷和加氫等處理，利用Sybyl-X 2.0軟件中的Surflex-Dock程序進行分子模擬對接，運行次數(shù)為100次[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑苦蕎提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

由圖1可知，苦蕎水提取物、80%乙醇提取物和30%丙酮提取物均對α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，并隨著質(zhì)量濃度的增大，抑制效果增強，其中80%乙醇提取物抑制效果最為明顯，其次為30%丙酮提取物，而水提取物相對較差，說明苦蕎中水溶性的成分(如多糖等)對α-葡萄糖苷酶活性影響較小，而極性相對較小的成分(如黃酮等)則影響較大，這與滕俊英等[20]和李艷琴等[21]的研究報道一致。

圖1 苦蕎不同溶劑提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

同時，在一定濃度范圍內(nèi)(8～32 mg/mL)80%乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用高于陽性對照藥物阿卡波糖，顯示了其良好的活性，因此后續(xù)實驗采用80%乙醇提取物進行。

2.2 HPLC分析

利用超濾管，將80%乙醇提取物中與α-葡萄糖苷酶結(jié)合的物質(zhì)，即發(fā)揮抑制作用的成分進行分離，收集后真空冷凍干燥，再加入200 μL甲醇-水溶液(50∶50，V/V，色譜純)復(fù)溶后進行HPLC分析，結(jié)果見圖2。分離得到的與α-葡萄糖苷酶結(jié)合的活性成分主要有3個，出峰時間集中在52～62 min。在相同液相條件下，通過與標準品的出峰時間進行比對，可以初步確定其中的兩種物質(zhì)分別為蘆丁和槲皮素。蘆丁是槲皮素的蕓香糖苷，兩者都屬于苦蕎中的黃酮類物質(zhì)。王斯慧等[22]研究表明，苦蕎黃酮對α-葡萄糖苷酶具有顯著的抑制作用，均優(yōu)于阿卡波糖，而朱麗艷等[23]的研究結(jié)果也表明，蕎麥中的黃酮和槲皮素可以顯著抑制大鼠小腸α-葡萄糖苷酶活性，并對大鼠餐后血糖也有明顯的抑制效果?？嗍w中黃酮的主要成分為蘆丁和槲皮素，因此上述研究結(jié)果與本實驗結(jié)果基本一致。此外，另一種出峰時間為56.55 min的活性成分則有待進一步研究。

圖2 HPLC圖

2.3 蘆丁和槲皮素對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

為了進一步驗證蘆丁和槲皮素對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，配制不同濃度的蘆丁和槲皮素溶液，按1.3.2方法驗證兩者的活性，結(jié)果如圖3所示。隨著質(zhì)量濃度的增加，槲皮素和蘆丁對α-葡萄糖苷酶活性的抑制也逐漸增強，二者呈一定的線性關(guān)系，其IC50值分別為32.22 μg/mL和121.05 μg/mL。Li等[14]研究表明，蘆丁和槲皮素均能與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，導(dǎo)致靜態(tài)的熒光淬滅效應(yīng)，形成一個新的復(fù)合物，其中槲皮素的結(jié)合常數(shù)大于蘆丁，說明槲皮素對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用比蘆丁強，這與本實驗結(jié)果一致。然而，由于苦蕎在萌動或加工過程中，蘆丁會被蘆丁降解酶水解，生成槲皮素，從而被吸收利用[24]，因此，兩者在體內(nèi)均可能對α-葡萄糖苷酶活性發(fā)揮顯著的抑制作用。

圖3 不同濃度槲皮素和蘆丁對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

2.4 分子模擬對接

為了進一步闡明蘆丁和槲皮素與α-葡萄糖苷酶之間相互作用的分子機制，采用Sybyl-X 2.0軟件分別對其進行分子模擬對接。由圖4可知，蘆丁和槲皮素均可嵌入α-葡萄糖苷酶的活性中心，與其發(fā)生相互作用，從而減少與底物之間的結(jié)合。其中，蘆丁分別可以與活性中心的GLU410、GLU2、GLU374和ARG28等氨基酸殘基形成氫鍵，其平均鍵長為2.19?，而槲皮素則主要與GLU374、ARG28和ASN9等氨基酸殘基相互作用，其中分別與GLU374和ARG28形成2個氫鍵。說明蘆丁和槲皮素與α-葡萄糖苷酶之間的主要相互作用力為氫鍵。研究表明，多酚類化合物中羥基數(shù)量與其α-葡萄糖苷酶抑制活性具有很強的相關(guān)性，特別是A環(huán)和C環(huán)上羥基的數(shù)目與位置尤為重要[25]。同時，多酚類物質(zhì)的分子量大小也會影響其α-葡萄糖苷酶抑制活性。相比于槲皮素，蘆丁含有更多的羥基，通過分子模擬對接可知，其與α-葡萄糖苷酶的多個氨基酸殘基形成氫鍵，從而抑制酶活性，然而由于其分子量較大，因此對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率反而更小[16]。此外，分子模擬對接結(jié)果也表明，與槲皮素相互作用，形成氫鍵的GLU374、ARG28和ASN9等氨基酸殘基對于α-葡萄糖苷酶的活性影響更顯著。

圖4 分子模擬對接圖

3 結(jié)論

本研究比較了苦蕎不同溶劑提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，結(jié)果表明80%乙醇提取物的抑制效果最為明顯，其次為30%丙酮提取物，而水提取物相對較差，說明苦蕎中發(fā)揮α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分主要溶解于80%乙醇溶劑中。以α-葡萄糖苷酶為“分子印跡”的模板，結(jié)合超濾技術(shù)和HPLC分析，從苦蕎80%乙醇提取物中初步篩選出3種活性成分，并鑒定出其中2種為苦蕎中的主要黃酮成分蘆丁和槲皮素。結(jié)果表明，蘆丁和槲皮素均可顯著抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其中槲皮素的作用效果更強。此外，分子模擬對接試驗進一步揭示了兩種活性成分與α-葡萄糖苷酶之間的相互作用機制。