儲(chǔ)糧害蟲磷化氫抗性檢測(cè)設(shè)備及應(yīng)用研究

單常堯 曹 陽 陳 鑫 何 曉 王莉君 張 濤

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院1，鄭州 450001) (國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院2，北京 100037) (杭州貝斯特氣體有限公司3，杭州 311404)

磷化氫作為糧食熏蒸劑有很多優(yōu)勢(shì)，比如它具有很高的熏蒸效率，還具有揮發(fā)性好、殺蟲毒力高、擴(kuò)散速度快、基本無殘留且不影響谷物品質(zhì)和種子活力、價(jià)格低廉、使用方便等特點(diǎn)[1]。昆蟲的耐藥性是指昆蟲首次接觸某種殺蟲劑所表現(xiàn)出的抵抗能力。也稱為天然抗性。多次不規(guī)范用藥易產(chǎn)生抗藥性。糧食行業(yè)長(zhǎng)期單一且不規(guī)范地使用磷化氧，加速了儲(chǔ)糧害蟲對(duì)磷化氫的抗性，最終導(dǎo)致害蟲對(duì)磷化氫的抗藥性越來越嚴(yán)重[2]。科研人員對(duì)磷化氫的殺蟲機(jī)理和毒理學(xué)機(jī)制進(jìn)行深入的研究，為科學(xué)使用磷化氫提供了理論基礎(chǔ)[3,4,5]，但儲(chǔ)糧害蟲磷化氫抗性的出現(xiàn)仍然是防治環(huán)節(jié)不可忽視的難題[6]。

傳統(tǒng)的磷化氫抗測(cè)定(FAO推薦抗性測(cè)定方法)過程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，且制得的磷化氫氣體濃度精確性不高，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)條件要求都比較嚴(yán)格，在實(shí)際應(yīng)用中存在很多問題，不利于基層操作[7,8]。為解決抗性測(cè)定過程中操作繁瑣、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)的問題，課題組對(duì)近年來我國(guó)主要儲(chǔ)糧害蟲對(duì)磷化氫的抗性測(cè)定方法進(jìn)行了研究。研發(fā)了磷化氫抗性測(cè)定設(shè)備，為進(jìn)一步驗(yàn)證設(shè)備的性能，本實(shí)驗(yàn)用抗性問題較為嚴(yán)重的銹赤扁谷盜作為試蟲，進(jìn)行了擊倒和熏蒸實(shí)驗(yàn)(FAO推薦方法)[9]。

1 材料與方法

1.1 試蟲和培養(yǎng)方法

實(shí)驗(yàn)所涉及每個(gè)品系的銹赤扁谷盜均已經(jīng)過國(guó)家糧食與物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院儲(chǔ)運(yùn)所儲(chǔ)糧害蟲飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室純化培養(yǎng)數(shù)十代。銹赤扁谷盜培養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室恒溫恒濕培養(yǎng)箱中32 ℃、78%RH、24 h無光照條件下。取數(shù)百頭成蟲，投入裝有飼料的500 mL玻璃瓶中，產(chǎn)卵3 d后篩出成蟲，放入另一個(gè)準(zhǔn)備好的玻璃瓶中飼養(yǎng)，然后將帶卵的小麥放回原瓶?jī)?nèi)置于培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，每3 d一批，待其子代發(fā)育到成蟲后，挑選2周齡的成蟲作為實(shí)驗(yàn)用蟲。于文江等[10]報(bào)道在溫度32 ℃、相對(duì)濕度75%～90%件下，卵發(fā)育到成蟲的羽化時(shí)間為20.3 d到27.5 d。

每種試蟲按國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院儲(chǔ)運(yùn)所的標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行培養(yǎng)。粉食性害蟲以全麥粉∶燕麥片∶酵母∶碎麥=5∶3∶3∶1的配比為飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，在溫度(30±2)℃，相對(duì)濕度(75±5)%的條件下培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

磷化氫鋼瓶氣體；磷化氫抗性測(cè)試設(shè)備由國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院提供；熏蒸瓶(50 mL)；試蟲培養(yǎng)箱；磷化氫氣體報(bào)警儀；恒溫干燥箱；小毛筆；培養(yǎng)皿；害蟲分選篩；漏斗。部分設(shè)備和器材如圖1所示。

所述儲(chǔ)糧害蟲磷化氫抗性檢測(cè)設(shè)備包括主管路、并聯(lián)管路、凈化管路和氣源管路，管路上連接有觀察裝置、氣體探測(cè)裝置、濾毒罐和凈化裝置等，工作原理主要包括4個(gè)階段，即N2吹掃階段、PH3/空氣測(cè)試階段、高/低濃度PH3探測(cè)階段和尾氣凈化階段[11]。

圖1 主要設(shè)備和器材

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 銹赤扁谷盜各品系抗性水平確定

WINKS等[12]曾報(bào)道在一定磷化氫濃度下，儲(chǔ)糧害蟲產(chǎn)生保護(hù)性昏迷的時(shí)間長(zhǎng)短與其磷化氫的抗性程度有密切關(guān)系。Waterford等[13]研究通過研究赤擬谷盜發(fā)現(xiàn)的儲(chǔ)糧害蟲致死時(shí)間與保護(hù)性昏迷的時(shí)間呈正相關(guān)。曹陽等[14，15]報(bào)道可通過害蟲擊倒時(shí)間快速判定害蟲是否產(chǎn)生抗性及抗性等級(jí)。這些結(jié)果表明儲(chǔ)糧害蟲磷化氫保護(hù)性昏迷(擊倒效應(yīng))與致死效應(yīng)具有一致性。基于以上研究，本實(shí)驗(yàn)采用曹陽等[14]研究的半數(shù)擊倒時(shí)間的方法確定儲(chǔ)糧害蟲的抗性品系與敏感品系及其抗性程度，并記錄其半數(shù)擊倒時(shí)間(KT50)。

首先從準(zhǔn)備好的試蟲中挑出同一品系同一世代的儲(chǔ)糧害蟲成蟲10頭放入熏蒸瓶?jī)?nèi)，置于磷化氫抗性測(cè)定設(shè)備中，將設(shè)備接通預(yù)先配好的磷化氫氣體濃度為2.0 mg/L的鋼瓶，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，觀察試蟲反應(yīng)情況。當(dāng)熏蒸瓶中的銹赤扁谷盜不能正常爬行或者出現(xiàn)痙攣反應(yīng)[16]，只有觸角能偶爾動(dòng)彈則視為被磷化氫擊倒(Konckdown)，將試蟲接觸磷化氫氣體開始到試蟲被擊倒的時(shí)間稱為擊倒時(shí)間(Konckdown Time,簡(jiǎn)記為KT)。觀察并記錄第5頭被磷化氫擊倒的時(shí)間為半數(shù)擊倒時(shí)間(KT50)[15]。

1.3.2 銹赤扁谷盜各品系抗性倍數(shù)測(cè)定

參照FAO(1975)推薦的熏蒸劑毒力測(cè)定方法，根據(jù)段錦艷等[17]提供的數(shù)據(jù)銹赤扁谷盜抗性鑒別濃度0.064 mg/L，設(shè)定熏蒸濃度梯度為0.060、0.050、0.040、0.030、0.020 mg/L，另外為保證實(shí)驗(yàn)的可靠性增設(shè)2倍抗性鑒別濃度0.120 mg/L[18]。將50頭體型相似且健壯的成蟲放入事先準(zhǔn)備好的熏蒸瓶中，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)平行，另外每個(gè)品系設(shè)置對(duì)照(以未經(jīng)磷化氫處理的試蟲作為空白對(duì)照)，重復(fù)2次。將熏蒸瓶置于設(shè)定條件下(25 ℃、(70±5)%RH)密閉熏蒸20 h，散氣后取出試蟲，加入適量飼料，保持在25 ℃，(70±5)%RH的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)14 d記錄害蟲死亡數(shù)量(判斷死亡標(biāo)準(zhǔn)為使用毛筆或解剖針觸動(dòng)時(shí)只有輕微肢體抽動(dòng)則判斷為死亡)，并計(jì)算死亡率、矯正死亡率和LC50值 ，對(duì)照組中若有死蟲出現(xiàn)，則通過Abbots公式校正，如果對(duì)照組死亡率大于10%需重新安排實(shí)驗(yàn)，若低于5%則可不必較正[19,20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)成蟲擊倒快速測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Microsoft Excel 2016進(jìn)行記錄整理，毒力測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Statistical Product and Service Solutions(SPSS)22.0和R-3.5.2進(jìn)行處理分析，得到不同品系的毒力回歸方程和抗性系數(shù)。

其中：Rf(抗性系數(shù))=(處理品系LC50/(敏感品系LC50)

Abbots:校正死亡率=

2 結(jié)果分析

2.1 銹赤扁谷盜各品系的磷化氫半數(shù)擊倒時(shí)間

磷化氫抗性擊倒快速測(cè)定的試驗(yàn)結(jié)果得到的半數(shù)擊倒時(shí)間如表 1所示。

表1 各個(gè)品系的銹赤扁谷盜成蟲的半數(shù)擊倒時(shí)間 KT50

當(dāng)測(cè)定品系KT50值大于30 min時(shí),為抗性品系害蟲;當(dāng)測(cè)定品系KT50值小于30 min時(shí)，為敏感品系害蟲[15,]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4個(gè)品系的銹赤扁谷盜均為抗性品系，其中內(nèi)蒙古通遼的品系所需擊倒時(shí)間比較短，基本接近敏感品系，其他3個(gè)品系的銹赤扁谷盜已經(jīng)具有比較高的抗性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在糧食流通不頻繁儲(chǔ)糧環(huán)境較穩(wěn)定的通遼地區(qū)的銹赤扁谷盜對(duì)磷化氫的抗性并不嚴(yán)重，而其他3個(gè)地區(qū)的銹赤扁谷盜對(duì)磷化氫的抗性則相對(duì)比較嚴(yán)重。

2.2 銹赤扁谷盜各品系抗性倍數(shù)

FAO推薦方法測(cè)定的4個(gè)品系的銹赤扁谷盜的磷化氫抗性倍數(shù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過進(jìn)行處理，結(jié)果如表2所示。

表2 不同品系銹赤扁谷盜的磷化氫抗性倍數(shù)測(cè)定

注：磷化氫的濃度由1 mg/L 換算mL/m3的系數(shù)按730計(jì)；銹赤扁谷盜各品系的抗性系數(shù)Rf=待測(cè)品系LC50值/FAO推薦敏感品系的LC50值(銹赤扁谷盜對(duì)磷化氫的敏感數(shù)值以通遼品系的進(jìn)行參考)。

敏感品系的致死中濃度參照嚴(yán)曉平等在“我國(guó)主要儲(chǔ)量害蟲抗性調(diào)查研究”中提到的敏感品系的LC50=0.011 mg/L為基準(zhǔn)(FAO推薦的敏感品系LC50值范圍為0.007～0.013 mg/L[22])。從表2數(shù)據(jù)中可以看出內(nèi)蒙古通遼品系屬于低抗性、接近敏感品系，其他3個(gè)品系(費(fèi)縣、南寧、廣州)的銹赤扁谷盜均已具有較高的抗性。致死中濃度LC50值為內(nèi)蒙古通遼(0.041 mg/L)<廣西南寧(0.407 mg/L)<山東費(fèi)縣(0.418 mg/L)<廣東廣州(0.500 mg/L)，半數(shù)擊倒時(shí)間KT50值為內(nèi)蒙古通遼(45 min)<廣西南寧(170 min)<山東費(fèi)縣(174 min)<廣東廣州(187 min)，抗性系數(shù)Rf值為蒙古通遼(3.727)<廣西南寧(36.727)<山東費(fèi)縣(38.000)<廣東廣州(45.455)，由此可見LC50與Rf、KT50的值均呈正相關(guān)關(guān)系。利用SPSS 22.0得出的內(nèi)蒙古通遼、廣西南寧、山東費(fèi)縣、廣東廣州4個(gè)品系的LC95分別為0.106 mg/L、1.994 mg/L、1.816 mg/L、2.737 mg/L，但所求結(jié)果LC95的95%置信區(qū)間均較寬，僅內(nèi)蒙古通遼品系的可靠性較高，因此本實(shí)驗(yàn)所得的LC95值并不適宜判斷害蟲的抗性程度，僅具有參考價(jià)值，造成該現(xiàn)象的原因可能是有效樣本數(shù)量不夠，高死亡率對(duì)數(shù)值變異程度影響過大或存在除磷化氫濃度以外的其他重要因素影響害蟲死亡年率。

2.3 銹赤扁谷盜各品系劑量濃度與死亡幾率值的對(duì)應(yīng)關(guān)系

將設(shè)定的磷化氫濃度進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，利用NORMSINV函數(shù)求得四個(gè)品系銹赤扁谷盜死亡幾率值，通過R語言ggplot2進(jìn)行線性回歸，繪制濃度對(duì)數(shù)-死亡幾率值回歸直線，結(jié)果如圖2所示。(注：若該濃度下死亡率為0，則舍棄該點(diǎn))

通過回歸直線可以從圖中直接得到lg(LC50)值，來比較抗性程度，但該值尚不足以反應(yīng)各品系之間的差異(由于費(fèi)縣、廣州、南寧品系的抗性較強(qiáng)，lg(LC50)值較大，因此圖中無法完全顯示)。毒力回歸方程Y=a+bX中的b值代表分散程度的大小，其中b值越大，直線坡度越大，則分散程度越小，該品系對(duì)對(duì)熏蒸劑反應(yīng)越均勻，反之則說明該品系有較大的異質(zhì)性，即個(gè)體之間抗性差異較大。

圖2 濃度對(duì)數(shù)-死亡幾率值與銹赤扁谷盜 對(duì)磷化氫的毒力回歸直線

根據(jù)毒力回歸方程可以發(fā)現(xiàn)b值的大小為內(nèi)蒙古通遼(3.939)>山東費(fèi)縣(2.578)>廣西南寧(2.393)>廣東廣州(2.228)，抗性品系的分散程度類似，但均低于敏感品系。分析原因可能為：抗性品系雜合程度較高，存在極端個(gè)體；在試蟲挑取過程中未分辨雌雄，存在性別對(duì)于抗性的影響；成蟲體型差異的影響；樣本量不大，無法消除測(cè)定過程的隨機(jī)誤差。

2.4 銹赤扁谷盜各品系lg(KT50)與lg(LC50)的相關(guān)性

將四個(gè)品系的銹赤扁谷盜的 KT50和 LC50的值進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換與回歸分析，運(yùn)行R語言進(jìn)行回歸分析，并利用ggplot2將分布點(diǎn)映射至圖像展示區(qū)域，即對(duì)分布點(diǎn)進(jìn)行可視化，結(jié)果如圖3所示。

表3 各品系銹赤扁谷盜實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 銹赤扁谷盜各品系的lg(LC50) 與lg(KT50)的相互關(guān)系

4個(gè)品系擊倒時(shí)間的順序?yàn)閺V東廣州>山東費(fèi)縣>廣西南寧>內(nèi)蒙古通遼，抗性倍數(shù)的順序?yàn)閺V東廣州 >山東費(fèi)縣 >廣西南寧>內(nèi)蒙古通遼?？梢姴煌废典P赤扁谷盜lg(LC50)與lg(KT50)的匹配度較高，且呈直線相關(guān)。因此KT50值可以在很大程度上反映抗性水平，甚至可以在測(cè)得害蟲半數(shù)擊倒時(shí)間KT50的基礎(chǔ)上利用回歸方程來推算出致死中濃度LC50，進(jìn)而預(yù)測(cè)出該種害蟲的抗性水平。

從圖3可以看出，不同品系的銹赤扁谷盜的lg(LC50)與lg(KT50)之間具有一定的相關(guān)性，其回歸方程的決定系數(shù)即R2為0.999 6，擬合度相對(duì)較好，其回歸方程為y= 1.735x-4.257。曹陽、王殿軒等[14,15]研究的結(jié)果相吻合，表明通過抗性測(cè)定裝置確定的LC50與KT50值準(zhǔn)確可靠，可以利用其對(duì)害蟲抗性水平進(jìn)行快速檢測(cè)。

3 討論

根據(jù)害蟲的抗性水平針對(duì)性的制定熏殺方案，是合理有效控制抗性害蟲的關(guān)鍵。FAO推薦的抗性測(cè)定方法是目前公認(rèn)的最為準(zhǔn)確的抗性測(cè)定方法，以熏蒸結(jié)束14 d的數(shù)據(jù)和已知敏感(參考)品系LC50為基線而確定，因此無法直接測(cè)定抗性水平，同時(shí)易受極端(極敏感或極高抗)品系的影響，而且測(cè)定過程復(fù)雜且耗時(shí)過長(zhǎng)，難以應(yīng)用于實(shí)踐。Waterford等[13]與曹陽等[14]研究表明可以采用擊倒50%成蟲的時(shí)間KT50代表這種害蟲的抗性水平，雖然該值有效的規(guī)避了極端品系的影響，可以較好的反應(yīng)集中趨勢(shì)，但磷化氫濃度的控制是決定該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確的重要因素。

針對(duì)以上兩種傳統(tǒng)方法存在的缺陷，本研究提出一種抗性測(cè)定裝置的方法：1)本裝置針對(duì)不同需求，提供兩種抗性測(cè)定模式，即實(shí)驗(yàn)室抗性水平精確測(cè)定(FAO推薦方法)和緊急熏蒸預(yù)案制訂(半數(shù)擊倒時(shí)間測(cè)定)模式，使之既可以準(zhǔn)確測(cè)定抗性水平又可以短時(shí)判斷抗性水平；2)該裝置采用鋼瓶裝磷化氫氣體作為氣源最大限度地保證了磷化氫濃度的精準(zhǔn)，無需氣體制備及濃度檢測(cè)環(huán)節(jié)，使操作過程盡可能簡(jiǎn)化；3)可以同時(shí)進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn)，有效規(guī)避了環(huán)境及人為因素造成的影響，最大限度的保證實(shí)驗(yàn)平行并提高實(shí)驗(yàn)效率；4)磷化氫濃度報(bào)警儀對(duì)每一時(shí)刻環(huán)境中磷化氫濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，以確保裝置氣密性良好無泄露，保證操作環(huán)境安全；5)設(shè)有尾氣吸收裝置，使磷化氫氣體不進(jìn)入大氣，不會(huì)造成尾氣污染。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)三個(gè)儲(chǔ)糧生態(tài)區(qū)4個(gè)品系的銹赤扁谷盜進(jìn)行抗性測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4個(gè)品系的半數(shù)擊倒時(shí)間KT50值與抗性倍數(shù)Rf值呈正相關(guān)關(guān)系；通過對(duì)不同品系的銹赤扁谷盜的lg(LC50)與lg(KT50)進(jìn)行線性回歸，發(fā)現(xiàn)兩變量之間的決定系數(shù)R2為0.999 6、P值為0.000 186 7，表明變量之間相關(guān)性較強(qiáng)且具有極顯著的線形相關(guān)性；不同儲(chǔ)糧生態(tài)區(qū)之間的銹赤扁谷盜的磷化氫抗性存在差異，同一儲(chǔ)糧生態(tài)區(qū)不同品系之間抗性也存在差異；從儲(chǔ)糧生態(tài)區(qū)的特點(diǎn)來說，低溫儲(chǔ)糧生態(tài)區(qū)(內(nèi)蒙古通遼)儲(chǔ)藏難度較小，害蟲抗性程度也低于中高溫儲(chǔ)糧生態(tài)區(qū)(山東費(fèi)縣、廣西南寧、廣東廣州)，與文獻(xiàn)中所述儲(chǔ)糧的難易程度和抗性水平高低一致的結(jié)論相符。以上通過抗性測(cè)定裝置和方法得到的關(guān)于銹赤扁谷盜磷化氫抗性的結(jié)論符合實(shí)際情況且存在理論支撐，因此證明該裝置所得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠，能夠?qū)崿F(xiàn)儲(chǔ)藏過程中害蟲抗性的快速、準(zhǔn)確測(cè)定，不僅適用于FAO推薦抗性測(cè)定方法抗性倍數(shù)Rf的測(cè)定也對(duì)現(xiàn)場(chǎng)熏蒸或制定應(yīng)急熏蒸預(yù)案過程中判斷抗性程度具有參考意義，是一種多用途、高準(zhǔn)確度的高效測(cè)定裝置和方法。