瑤山甜茶通過調(diào)節(jié)線粒體自噬改善糖尿病大鼠并發(fā)癥的實(shí)驗(yàn)研究

鄭 華1 魏秋梅1 孟春梅1 莫肖敏1 李衛(wèi)東1 成曉靜1 蘇志恒2

1.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021;2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室,廣西 南寧 530021

糖尿病是一組以高血糖和高血脂為特征的代謝性疾病，由此引發(fā)的心血管和微血管并發(fā)癥成為致死、致殘的主要原因。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和形成能量的主要場所，調(diào)控細(xì)胞增殖與能量代謝。線粒體在氧化磷酸化產(chǎn)能過程中伴隨著活性氧(ROS)的產(chǎn)生，線粒體損傷，糖尿病糖脂毒性直接或間接導(dǎo)致氧化磷酸化障礙，ROS增多，加重線粒體的損傷，促凋亡因子釋放增多，細(xì)胞凋亡形成增多。為了維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞通過選擇性清除受損的線粒體，形成自噬體，降解其內(nèi)容物，補(bǔ)充細(xì)胞能量，稱為線粒體自噬。細(xì)胞大多通過線粒體途徑凋亡，是單向性的，而線粒體自噬清除受損的線粒體，減少ROS，減輕線粒體外膜通透化，防止受損的線粒體釋放細(xì)胞色素C等線粒體促凋亡蛋白從而抑制凋亡，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，是雙向性的。線粒體自噬與凋亡的合作、對(duì)抗亦或推動(dòng)的關(guān)系成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[1-2]。

廣西瑤山甜茶(RubussuavissimusS.Lee)，為薔薇科懸鉤子屬多年生有刺灌木，主要分布在廣西壯族自治區(qū)金秀、藤縣、蒼梧等地，生長在海拔500～1000米處大瑤山山區(qū)，是廣西壯族自治區(qū)民間壯、瑤族人民用于治療糖尿病、肥胖癥的民族常用藥，療效確切，被喻為瑤藥中的“神茶”，在廣西民間已有幾百年的使用歷史，也是通過了美國FDA認(rèn)證的具有藥、糖、茶三重功效的甜味植物。廣西瑤山甜茶中不僅含有黃酮類、二萜及其苷類、甜茶素、甜茶多酚、鞣質(zhì)等化學(xué)成分，而且含有多種維生素、氨基酸、微量元素，其中甜茶素是其最主要發(fā)揮藥效的化學(xué)成分。有研究表明，瑤山甜茶對(duì)心血管病、 高血壓、 動(dòng)脈硬化，糖尿病腎病等糖尿病并發(fā)癥也具有一定的療效[3-4]，但具體的作用機(jī)制未明。本實(shí)驗(yàn)旨在初步探討廣西瑤山甜茶對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠血糖及各器官超微結(jié)構(gòu)的改變，探討其治療糖尿病并發(fā)癥的新靶點(diǎn)，為其進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑 廣西瑤山甜茶采自廣西壯族自治區(qū)金秀縣大瑤山，由廣西藥用植物研究所莫長明副研究員鑒定為薔薇科懸鉤子屬廣西甜茶。鏈脲佐菌素(純度>98%,Sigma公司，批號(hào):S0130)；鹽酸二甲雙胍(中美上海施貴寶有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：AAB7135)。

1.2 儀器 Accu-Chek Performa型血糖儀(德國羅氏診斷有限公司)，TDL-33型臺(tái)式低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，H-7650透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-(桂)2014-0002。

2 方法

2.1 廣西甜茶提取液的制備 稱取100 g 的廣西瑤山甜茶葉，去除多余的枝干，曬干粉碎。添加10倍量的蒸餾水微沸提取兩次，每次2 h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)真空濃縮濾液至50 mL左右，定容至100 mL，即得甜茶總水提取物濃縮液(濃度：1 g·mL-1)，放入-20 ℃冰箱凍存。

2.2 糖尿病大鼠模型的建立及分組 選取重量(200±20)g，雄性SD大鼠60只，動(dòng)物在室溫為20～24 ℃，相對(duì)濕度50%～70%的人工模擬自然晝夜環(huán)境條件下飼養(yǎng)，動(dòng)物自由攝食飲水，經(jīng)適應(yīng)l周后開始實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)取10只大鼠作為正常組，其余大鼠造模。在大鼠禁食不禁水12 h后，將STZ溶于0.1 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.2～4.5)，在避光條件下配制成濃度為1%的溶液，按STZ 55 mg·kg-1作單次腹腔注射，正常對(duì)照組注射相同體積的0.1 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.2～4.5)。72 h 后至少連續(xù)3 d尾靜脈檢測血糖。以連續(xù)3次測得血糖≥16.7 mmol·L-1為糖尿病模型大鼠。選取以上造模方法獲得造模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分為4組即模型組、甜茶高劑量組、甜茶低劑量組、陽性藥組，每組6只。

2.3 給藥方式 正常對(duì)照組與模型對(duì)照組每天給予相等容積生理鹽水灌胃，陽性藥二甲雙胍組給予體質(zhì)量200 mg·kg-1灌胃，瑤山甜茶高劑量治療組、低劑量治療組每天分別給予6 g·kg-1，3 g·kg-1體質(zhì)量灌胃，連續(xù)6周。每天1次，每周根據(jù)體重調(diào)整用量。

2.4 各組大鼠空腹血糖值 分別于給藥后第0周、第2周、第4周、第6周將小鼠禁食、不禁水12 h，稱重，測定小鼠空腹血糖。

2.5 各組大鼠肝、心臟、腎臟臟器指數(shù) 將大鼠斷頭處死，取出肝、心臟、腎臟等器官，用生理鹽水洗去血污，吸干水分，稱重，計(jì)算肝臟、心臟及腎臟臟器指數(shù)。

2.6 各組大鼠心肌組織、腎組織、肝組織超微結(jié)構(gòu)觀察 取各組大鼠心肌組織、腎組織、肝組織各1 mm3，立即投入3%預(yù)冷的戊二醛固定液中固定2 h后，0.1 mol 磷酸鹽緩沖液清洗3次，鋨酸固定，0.1 mol磷酸鹽緩沖液清洗3次，乙醇梯度脫水(50%、70%、80%、90%、100%)，乙醇丙酮1∶1(濃度為90%)脫水，100%丙酮脫水3次，用618包埋劑、DDSA、DBP、DMP-30調(diào)和劑滲透包埋，放入烘箱聚合(38 ℃ 12 h，45 ℃ 12 h，60 ℃ 48 h)，超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛分別染色5 min，日立H-7650透射電鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 瑤山甜茶對(duì)各組大鼠空腹血糖值的影響 與正常組比較，模型組大鼠血糖在各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，陽性藥組和甜茶提取物低劑量組從第2周就開始顯著降低(P<0.01)，甜茶提取物高劑量組血糖在第6周顯著降低(P<0.05)。見表1。

組別0周2周4周6周Control6.13±0.376.95±0.536.07±0.685.93±0.31Model28.25±3.49##27.55±2.463##29.73±2.23##27.50±6.65##Positive28.28±2.2615.23±5.966??12.00±4.86??15.17±5.13??L-RS21.75±5.2320.65±8.11??19.00±4.46??15.17±5.13??H-RS27.45±5.2326.40±3.4426.37±3.5920.87±4.04?

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01。

3.3 瑤山甜茶提取物對(duì)各組大鼠臟器指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝臟、心臟及腎臟指數(shù)均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，甜茶高劑量組、低劑量組和陽性藥組大鼠肝臟指數(shù)、心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。見表3。

組別肝臟指數(shù)心臟指數(shù)腎臟指數(shù)Control2.55±0.160.32±0.040.52±0.02 Model4.46±0.30##0.40±0.03##1.17±0.13##Positive2.80±0.17??0.33±0.01??0.66±0.07??H-RS2.74±0.37??0.34±0.44?0.75±0.15??L-RS3.52±0.70?0.38±0.07?0.88±0.25?

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01 。

3.4 瑤山甜茶對(duì)各組大鼠心肌組織、腎組織、肝組織超微結(jié)構(gòu)的影響 如圖1(A-C)，模型組大鼠心肌細(xì)胞線粒體空泡化，線粒體嵴斷裂，排列紊亂，心肌肌絲排列紊亂，Z線扭曲，糖原顆粒聚集，而甜茶提取物組大鼠心肌細(xì)胞線粒體排列整齊，線粒體空泡化程度減輕，肌絲排列整齊，出現(xiàn)雙層膜的自噬小體，里面可見包含殘缺的線粒體嵴等內(nèi)容物，未見凋亡小體。

如圖1(D-F)，模型組大鼠大部分腎小球基底膜明顯增厚或厚薄不均，系膜基質(zhì)增多，足細(xì)胞足突廣泛融合,上皮細(xì)胞線粒體腫脹、結(jié)構(gòu)紊亂，可見散在高電子密度沉積物，部分腎小管基底膜增厚，可見足細(xì)胞細(xì)胞核核染色質(zhì)邊集，呈細(xì)胞凋亡早期病變，而甜茶提取物組大鼠腎小球、腎小管基底膜局部增厚，系膜基質(zhì)輕度增加，足突部分融合，部分區(qū)域可見完整的足突排列，上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體改變較輕，部分細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)雙層膜的自噬小體，內(nèi)包含少許線粒體嵴等內(nèi)容物。

如圖1(G-I)，模型組大鼠肝細(xì)胞核染色質(zhì)邊集，線粒體嵴消失、線粒體空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張嚴(yán)重，甜茶提取物組大鼠肝細(xì)胞線粒體腫脹程度減輕，凋亡減少，可見不同程度的自噬小體，包含破壞的線粒體膜和線粒體嵴等細(xì)胞器，或者與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體。

4 討論

自噬是真核細(xì)胞內(nèi)特有的一種高度保守的代謝過程，通過清除胞質(zhì)內(nèi)受損或老化的細(xì)胞器及其代謝產(chǎn)物，從而維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。線粒體自噬是調(diào)控線粒體質(zhì)量平衡和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，其發(fā)生的大致過程包括：細(xì)胞內(nèi)的線粒體先發(fā)生去極化損傷，受損線粒體首先被雙層膜結(jié)構(gòu)所包裹，形成自噬體，然后被運(yùn)輸至溶酶體，并和溶酶體融合而形成自噬溶酶體，之后在溶酶體酶的作用下降解被包裹的線粒體，完成整個(gè)自噬過程[5]。在細(xì)胞自噬的研究中，用電子顯微鏡觀察細(xì)胞質(zhì)中雙層膜包裹所形成的自噬體是評(píng)估自噬的形態(tài)學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)。

糖尿病心肌病(DCM)是一種常見的糖尿病并發(fā)癥，心肌細(xì)胞的糖、脂代謝與能量代謝異常導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡、壞死和心肌纖維化引起的心肌結(jié)構(gòu)改變。線粒體是心肌細(xì)胞能量代謝重要場所，在DCM的發(fā)病機(jī)理中具有重要作用。研究表明，細(xì)胞自噬在心臟重構(gòu)中起著至關(guān)重要的保護(hù)作用，能夠維持心臟功能以及心肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[6]。心肌細(xì)胞通過線粒體自噬(mitophagy)作用不斷清除受損或老化的線粒體，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[7]。本實(shí)驗(yàn)中糖尿病模型大鼠出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大，肌絲扭曲，肌原纖維收縮蛋白明顯減少，線粒體嵴碎裂、消失，線粒體空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，心肌細(xì)胞呈凋亡狀態(tài)改變，甜茶提取物組能顯著恢復(fù)心肌細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)，且出現(xiàn)了線粒體自噬現(xiàn)象，觀察到線粒體形態(tài)較完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張減輕，心肌細(xì)胞凋亡減少，提示瑤山甜茶提取物能增強(qiáng)心肌細(xì)胞線粒體自噬，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌細(xì)胞損傷，從而改善糖尿病心肌病。

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥，亦是引起終末期腎功能衰竭的主要原因，是糖尿病病人主要死因。足細(xì)胞被稱為腎小球臟層上皮細(xì)胞，是一種高度特異性終末期分化的細(xì)胞，高血糖高血脂產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)對(duì)足細(xì)胞有直接損傷的作用，ROS能引起線粒體蛋白、脂質(zhì)及線粒體DNA的損傷，導(dǎo)致線粒體功能障礙，細(xì)胞凋亡增加，機(jī)體通過線粒體自噬清除過多的ROS損傷的線粒體，從而延長細(xì)胞壽命[8]。足細(xì)胞損傷是慢性腎病病程進(jìn)展的主要因素，也是臨床治療的重要靶點(diǎn)[9]。本實(shí)驗(yàn)中糖尿病模型大鼠出現(xiàn)足細(xì)胞超微形態(tài)學(xué)改變，線粒體空泡化，足細(xì)胞足突融合，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體擴(kuò)張，核形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)邊集，細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡的早期形態(tài)改變。甜茶提取物可降低糖尿病大鼠的腎臟指數(shù)，改善腎小球足細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，減輕足突融合，清除受損的線粒體，抑制細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為空泡化的線粒體減少，足細(xì)胞凋亡減輕，出現(xiàn)包裹著殘缺線粒體的自噬小體，提示瑤山甜茶提取物可調(diào)節(jié)線粒體自噬抑制足細(xì)胞凋亡。

肝臟是機(jī)體內(nèi)物質(zhì)代謝的主要場所，在血糖調(diào)節(jié)中起著重要作用。肝臟脂肪蓄積和線粒體功能障礙是糖尿病肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。研究表明，選擇性線粒體自噬調(diào)控線粒體質(zhì)量，減少受損線粒體蓄積，調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量平衡[10-11]，在疾病早期適度激活細(xì)胞自噬，可能成為治療糖尿病肝損傷的有效途徑[12]。糖尿病大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)脂滴增多，線粒體空泡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊狀擴(kuò)張并脫顆粒，溶酶體增多，糖原顆粒減少，細(xì)胞核固縮、碎裂，核溶解，凋亡狀態(tài)改變。本研究中，經(jīng)甜茶提取物作用后，細(xì)胞內(nèi)脂滴減少，并出現(xiàn)包含脂滴和線粒體的自噬體，線粒體空泡化減輕，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張減輕，細(xì)胞凋亡減少。

綜上所述，低劑量廣西甜茶提取物(3 g/kg)和高劑量廣西甜茶提取物(6 g/kg)灌胃糖尿病大鼠后，均可使其血糖明顯下降，差異具有顯著性，說明廣西甜茶對(duì)糖尿病大鼠具有明顯的降血糖作用，且低劑量甜茶提取物效果較高劑量效果好。甜茶提取物能減少糖尿病大鼠肝、心、雙腎的臟器指數(shù)，改善糖尿病大鼠心肌、腎組織、肝組織的超微結(jié)構(gòu)，表明甜茶提取物可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生線粒體自噬從而減少凋亡的發(fā)生，維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，改善糖尿病并發(fā)癥。但線粒體自噬在其中是如何作用的？其具體的分子機(jī)制以及與凋亡的線粒體途徑的相互作用關(guān)系如何？將在線粒體自噬相關(guān)蛋白和基因的水平上闡明。本研究提示線粒體自噬有可能為瑤山甜茶有效活性成分降糖及改善糖尿病并發(fā)癥的新靶點(diǎn)，為瑤山甜茶進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。