藍(lán)莓提取物對(duì)改善小鼠睡眠剝奪型記憶力減退的影響研究

楊闖，潘順圓，劉鑫悅，李震東，楊帆，裴娜，孫磊，任永寧，孔凡志

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

在哺乳動(dòng)物中，睡眠是一種既普通又異常重要的生理過(guò)程。哺乳動(dòng)物的睡眠呈現(xiàn)周期性、可逆性和自發(fā)性等特點(diǎn)。已有研究證實(shí)，良好的睡眠對(duì)于動(dòng)物體的多種機(jī)能具有恢復(fù)作用，包括記憶鞏固、增強(qiáng)免疫力和記憶力鞏固等。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，睡眠缺乏可引起過(guò)度嗜睡、內(nèi)分泌紊亂、認(rèn)知功能下降和增加患心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)等[1]。因此，保證充足的睡眠對(duì)與動(dòng)物機(jī)體發(fā)揮正常生理功能至關(guān)重要。但是，隨著現(xiàn)在生活節(jié)奏的不斷加快，成人和兒童的夜間活動(dòng)時(shí)間顯著增加，睡眠時(shí)間明顯減少，不同程度的出現(xiàn)了睡眠剝奪的現(xiàn)象。睡眠剝奪是指由于環(huán)境或自身原因無(wú)法滿足正常睡眠，表現(xiàn)為睡眠減少或睡眠的連續(xù)性中斷，長(zhǎng)期睡眠剝奪很容易導(dǎo)致行為水平下降、注意力不集中、記憶力喪失和學(xué)習(xí)能力下降等反應(yīng)[2]。睡眠剝奪作為普遍而強(qiáng)烈的應(yīng)激源，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改變血腦屏障的通透性誘發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)損傷[3-4]。2019年度中國(guó)青少年兒童睡眠健康白皮書(shū)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)青少年兒童睡眠低于標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間，睡眠不足已成為常態(tài)：越睡越晚，越起越早，睡眠時(shí)間越來(lái)越少；睡眠困擾較多，入睡困難、張口呼吸等問(wèn)題相對(duì)突出；中學(xué)生群體發(fā)生較多。有研究表明，睡眠剝奪可對(duì)身體健康造成不同程度的影響，但睡眠剝奪對(duì)記憶力影響的機(jī)理研究仍然有限[5-6]。

藍(lán)莓為越桔屬植物，果實(shí)呈藍(lán)色，其中含有多種生物活性物質(zhì)，具有很好的保健功能并且擁有極高的藥用價(jià)值[7]。藍(lán)莓中富含的原花青素和花青素在機(jī)體抗氧化、減少炎癥、降低DNA 損傷和抗細(xì)胞凋亡等諸多方面發(fā)揮重要作用[8-10]。有研究表明，予以小鼠藍(lán)莓提取物處理8 個(gè)月后，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠在Y 迷宮測(cè)試中消耗時(shí)間顯著減少且學(xué)習(xí)記憶成績(jī)有明顯的提升[11]。給19 月齡的老齡大鼠飼喂藍(lán)莓8 周后，其記憶錯(cuò)誤次數(shù)減少且認(rèn)知功能提高[12]。應(yīng)用藍(lán)莓提取物和復(fù)合營(yíng)養(yǎng)素飼喂衰老大鼠，其學(xué)習(xí)記憶能力以及機(jī)體抗氧化功能得到明顯的改善[13-14]。然而，藍(lán)莓提取物能否改善青年小鼠由于睡眠剝奪導(dǎo)致的記憶力減退尚不明確。因此，項(xiàng)目應(yīng)用發(fā)明的小鼠睡眠剝奪裝置，對(duì)4 周齡小鼠進(jìn)行睡眠剝奪，同時(shí)使用藍(lán)莓提取物灌胃，然后采用TM-vision 泰盟水迷路行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)分析其記憶力變化情況。觀察、比較藍(lán)莓提取物灌胃對(duì)于小鼠睡眠剝奪型記憶力減退的影響，為后續(xù)開(kāi)發(fā)改善記憶力減退的藥物奠定理論與試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4 周齡SPF 級(jí)雌性昆明小鼠購(gòu)買(mǎi)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，小鼠首先在動(dòng)物房使用標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水自由飲食一周，分組并分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境清潔通風(fēng)良好。實(shí)驗(yàn)涉及的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作符合黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（20180328002）。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

TM-vision 泰盟水迷路行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)（中國(guó)成都）；小鼠用睡眠剝奪裝置；藍(lán)莓提取物通過(guò)溶劑萃取法獲得，純度為50%，購(gòu)自西安瑞林生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)用PBS 購(gòu)買(mǎi)自Hyclone 公司（美國(guó)）。

1.3 動(dòng)物分組與藍(lán)莓提取物灌胃

將15 只4 周齡SPF 級(jí)雌性昆明小鼠根據(jù)體重情況隨機(jī)分為3 組，對(duì)照組、睡眠剝奪組和藍(lán)莓提取物灌胃組，每組5 只。藍(lán)莓提取物灌胃組小鼠予以5 mg·kg-1體重的藍(lán)莓提取物水溶液進(jìn)行灌胃，每天灌胃一次。對(duì)照組和睡眠剝奪組予以等量蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃21 d。

1.4 小鼠睡眠剝奪模型的建立

采用我們發(fā)明的小鼠睡眠剝奪裝置，應(yīng)用改良多平臺(tái)睡眠剝奪法，在藍(lán)莓提取物灌胃的第15 天開(kāi)始對(duì)睡眠剝奪組和藍(lán)莓提取物灌胃組小鼠進(jìn)行18 h剝奪，6 h 恢復(fù)休息的睡眠剝奪處理。各組小鼠自造模的第1 天下午6 點(diǎn)開(kāi)始進(jìn)入睡眠剝奪箱內(nèi)進(jìn)行睡眠剝奪試驗(yàn)，次日中午12 點(diǎn)恢復(fù)睡眠，睡眠剝奪造模共計(jì)7 d。睡眠剝奪試驗(yàn)期間光照節(jié)律為12 h 光照（5：00～17：00）和12 h 黑暗（17：01～4：59）。睡眠剝奪裝置為大鼠籠改造的簡(jiǎn)易睡眠剝奪箱，大鼠籠底部各固定5 個(gè)直徑約為2.3 cm，高度為5 cm 的圓臺(tái)形平臺(tái)，平臺(tái)材料為PP 塑料，箱內(nèi)注入清水至距平臺(tái)頂端約0.5 cm 處左右，保持箱內(nèi)水溫為25±2 ℃，箱上覆蓋有鐵網(wǎng)，每天定時(shí)清洗箱內(nèi)排泄物并更換箱內(nèi)的水。

1.5 泰盟TM-vision 水迷路試驗(yàn)

試驗(yàn)開(kāi)始前，先將小鼠放置于水迷路裝置的起點(diǎn)平臺(tái)處，讓其適應(yīng)水迷路平臺(tái)環(huán)境，時(shí)間大約為5 min。然后，將小鼠面壁放置于遠(yuǎn)離起點(diǎn)平臺(tái)的固定水域，放手后，小鼠自行尋找至起點(diǎn)平臺(tái)并登上平臺(tái)后試驗(yàn)結(jié)束，記錄小鼠所需時(shí)間。藍(lán)莓灌胃期間所有小鼠每天進(jìn)行5 次水迷路訓(xùn)練，讓其形成記憶。從訓(xùn)練的第15 天開(kāi)始，對(duì)睡眠剝奪組小鼠和藍(lán)莓提取物灌胃組小鼠進(jìn)行睡眠剝奪，睡眠剝奪周期為每天18：00到次日12：00 共計(jì)18 h，連續(xù)進(jìn)行睡眠剝奪7 d。在訓(xùn)練的第22 天和第23 天，也就是睡眠剝奪7 d 后，使用泰盟TM-vision 水迷路行為學(xué)檢測(cè)裝置檢測(cè)小鼠搜索平臺(tái)所需時(shí)間是否發(fā)生變化。每只小鼠記錄6 次登上平臺(tái)所用時(shí)間，取平均值作為最終數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件為SPSS17.0，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以冀±SD 表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 睡眠剝奪對(duì)小鼠記憶力的影響

在使用泰盟TM-vision 水迷路裝置進(jìn)行記憶力訓(xùn)練過(guò)程中，隨著訓(xùn)練的天數(shù)不斷增加，各組小鼠由投放水域自行尋找到起點(diǎn)平臺(tái)所用的時(shí)間逐漸縮短（表1），表明，小鼠經(jīng)過(guò)訓(xùn)練已經(jīng)對(duì)平臺(tái)的位置產(chǎn)生記憶。然而，自睡眠剝奪開(kāi)始的第2 天起，與對(duì)照組相比，睡眠剝奪組小鼠從投放水域自行尋找起點(diǎn)平臺(tái)的時(shí)間有明顯的增加（P≤0.05）（表2）。表明，小鼠經(jīng)睡眠剝奪處理后，其記憶力顯著減退。

表1 水迷路訓(xùn)練對(duì)小鼠記憶力的影響Table 1 Effects of water maze training on the faculty of mice memory

表2 睡眠剝奪對(duì)小鼠記憶力的影響Table 2 Effects of sleep deprivation on the faculty of mice memory

2.2 藍(lán)莓提取物灌胃對(duì)小鼠體重的影響

為了確定藍(lán)莓提取物是否影響小鼠胃腸道的消化與吸收功能，給予小鼠藍(lán)莓提取物灌胃處理，共灌胃21 d。每天一次，灌胃濃度為5 mg·kg-1體重。每天記錄小鼠的精神狀態(tài)和糞便狀態(tài)，并定時(shí)稱量小鼠體重。結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，藍(lán)莓提取物灌胃后小鼠精神狀態(tài)沒(méi)有改變、無(wú)腹瀉發(fā)生且體重沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）（表3）。表明，藍(lán)莓提取物灌胃的量與方式對(duì)小鼠精神狀態(tài)、胃腸道消化與吸收及體重沒(méi)有影響。

表3 藍(lán)莓提取物對(duì)小鼠體重的影響Table 3 Effects of blueberry extracts on the body weight of mice

2.3 藍(lán)莓提取物對(duì)小鼠睡眠剝奪型記憶力減退的影響

為了確定藍(lán)莓提取物灌胃對(duì)青年小鼠睡眠剝奪型記憶力減退的影響，給予對(duì)照組和睡眠剝奪組小鼠蒸餾水灌胃，藍(lán)莓提取物灌胃組小鼠以劑量為5 mg·kg-1體重的藍(lán)莓提取物進(jìn)行灌胃，同時(shí)使用泰盟TM-vision 水迷路裝置對(duì)小鼠進(jìn)行平臺(tái)搜索訓(xùn)練（5 次·d-1），共計(jì)21 d。從平臺(tái)搜訓(xùn)練的第15 天開(kāi)始，對(duì)睡眠剝奪組和藍(lán)莓提取物灌胃組小鼠進(jìn)行18 h（18：00 到次日12：00）的睡眠剝奪，共進(jìn)行7 d。睡眠剝奪后，也就是第22 天和第23 天，用泰盟TM-vision 水迷路裝置檢測(cè)小鼠的平臺(tái)搜索時(shí)間變化情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組和睡眠剝奪組小鼠相比，藍(lán)莓提取物灌胃組小鼠的平臺(tái)搜索時(shí)間沒(méi)有發(fā)生顯著變化（P＞0.05）（表4）。表明，藍(lán)莓提取物對(duì)改善青年小鼠睡眠剝奪型記憶力減退沒(méi)有明顯效果。

表4 藍(lán)莓提取物對(duì)睡眠剝奪導(dǎo)致的小睡記憶力減退的影響Table 4 Effects of blueberry extracts on sleep deprivation induced hypomnesia of mice

3 討論

睡眠是人類和多種哺乳動(dòng)物生活中重要的組成部分，高質(zhì)量的睡眠是保證身體健康的必要條件。由于疾病或職業(yè)需求導(dǎo)致的失眠嚴(yán)重影響工作效率及身心健康，而且疲勞也是引發(fā)意外事故的主要原因。由于睡眠障礙引發(fā)的認(rèn)知功能和記憶力下降被WHO 認(rèn)定為重大公共安全衛(wèi)生問(wèn)題。睡眠剝奪一般是由環(huán)境或個(gè)體自身因素引起，導(dǎo)致個(gè)體難以進(jìn)入睡眠狀態(tài)的一種情況，隨著人們生活節(jié)奏的不斷加快，工作、學(xué)習(xí)壓力越來(lái)越大，人們普遍受到由睡眠不足導(dǎo)致的睡眠剝奪狀態(tài)的威脅[15-17]。這種情況在青少年群體發(fā)生率更高長(zhǎng)時(shí)間處于睡眠剝奪狀態(tài)的青少年，會(huì)產(chǎn)生一系列不良表現(xiàn)，如學(xué)習(xí)效率降低、學(xué)習(xí)效果變差、精神面貌渙散、免疫力低經(jīng)常感冒、炎癥頻發(fā)等身體問(wèn)題。有研究表明，人和動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力受損程度與睡眠剝奪的持續(xù)時(shí)間成正比[18-19]。然而，市場(chǎng)上尚無(wú)顯著改善睡眠剝奪導(dǎo)致記憶力減退的產(chǎn)品。

人類和動(dòng)物的睡眠剝奪試驗(yàn)被廣泛用于研究睡眠功能等相關(guān)問(wèn)題，睡眠剝奪對(duì)大腦活動(dòng)的宏觀影響包括皮層對(duì)外界刺激的響應(yīng)降低，主要表現(xiàn)為注意力不集中。睡眠剝奪對(duì)大腦的微觀影響主要是腺苷水平的降低。然而，在不同觀察尺度下，睡眠剝奪影響神經(jīng)系統(tǒng)功能的機(jī)理尚不明確。但是，研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)過(guò)7 d，每天18 h 的睡眠剝奪后，其在進(jìn)行泰盟TM-vision 水迷路試驗(yàn)過(guò)程中，搜索平臺(tái)的時(shí)間顯著高于對(duì)照組小鼠。表明睡眠剝奪能夠?qū)е滦∈蟪霈F(xiàn)記憶力減退的現(xiàn)象。將在后續(xù)研究中檢測(cè)睡眠剝奪組小鼠海馬區(qū)中BDNF、p-ERK 及PDEs 指標(biāo)變化情況及海馬區(qū)的形態(tài)變化，為明確睡眠剝奪導(dǎo)致的小鼠記憶力減退的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

藍(lán)莓果實(shí)中富含花青素、單寧、黃酮、多酚、多糖等多種生物活性物質(zhì)，具有極高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）確定為人類五大健康食品之一[20]。已有研究證明，藍(lán)莓提取物具有良好的清除氧自由基、抗氧化、預(yù)防癌癥、延緩衰老、緩解視疲勞和提高免疫力等功能。藍(lán)莓提取物在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也擁有廣泛的生物作用，對(duì)心腦血管疾病、炎癥以及阿爾茲海默病等都有一定的積極作用。在研究中，以劑量為5 mg·kg-1體重的藍(lán)莓提取物對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃21 d。未發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)精神萎靡、腹瀉、嘔吐或體重下降的情況，表明藍(lán)莓提取物灌胃的量與給藥方式對(duì)于小鼠不會(huì)造成傷害，以上劑量和給藥方式是安全的。Miller[21]在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，給19 月齡F344 老齡大鼠飼料中添加藍(lán)莓、菠菜和草莓的提取物，可逆轉(zhuǎn)其認(rèn)知功能缺陷。Krikorian等[22]的研究表明，飲食中補(bǔ)充藍(lán)莓可提高老年人的記憶力。Whyte 等[23-24]采用隨機(jī)雙盲試驗(yàn)證明低劑量的藍(lán)莓提取物（ThinkBlueTM） 可提高老年人記憶力。McNamara 等[25]的研究表明魚(yú)油與藍(lán)莓聯(lián)用對(duì)于改善老人主觀認(rèn)知障礙具有改善作用。然而，在研究中，采用的藍(lán)莓提取物并未對(duì)小鼠睡眠剝奪型記憶力減退產(chǎn)生顯著等改善作用。分析有如下原因：（1）泰盟TM-vision 水迷路試驗(yàn)中的水溫過(guò)低，可能導(dǎo)致小鼠處于冷應(yīng)激狀態(tài)，使得小鼠搜索平臺(tái)過(guò)程中產(chǎn)生了額外刺激因素，影響其平臺(tái)搜索時(shí)間；（2）研究中選擇的藍(lán)莓提取物中有效成分少，灌胃量不足；（3）藍(lán)莓提取物攝入周期較短。因此，將在接下來(lái)的研究中選擇多種藍(lán)莓提取物，且延長(zhǎng)灌胃時(shí)間，比較不同藍(lán)莓提取物對(duì)青年小鼠睡眠剝奪型記憶力減退的改善作用。通過(guò)檢測(cè)小鼠海馬區(qū)SOD、GSH-Px 和p-ERK水平探索藍(lán)莓提取物改善青年小鼠睡眠剝奪型記憶力減退的分子機(jī)理。