愛德華菌免疫刺激下牙鲆相關(guān)基因的表達(dá)分析

摘要：通過腹腔注射愛德華菌人工感染牙鲆，觀察不同時(shí)間段內(nèi)MyD88基因、IL-1基因及TNF基因表達(dá)的情況，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)這些基因進(jìn)行定量和定性分析。結(jié)果表明三基因均參與了牙鲆人工感染愛德華菌后的免疫反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：牙鲆;愛德華菌;MyD-88基因;IL-1基因;TNF基因;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1緒論

目前，對(duì)于牙鲆患細(xì)菌性疾病——愛德華菌病的控制傳統(tǒng)方法是采用抗生素類藥物。但此方法雖可部分治療愛德華菌病并限制其蔓延，但易造成抗生素類等藥物的積累，使生態(tài)環(huán)境遭到破壞，打破平衡。因此尋找并開發(fā)合適的魚類疾病免疫技術(shù)日漸重要。目前，研究魚類免疫系統(tǒng)可為研究育苗、育種，提高魚類的免疫力、促進(jìn)漁業(yè)快速發(fā)展提供重要依據(jù)。[1]

2方法

2.1愛德華菌培養(yǎng)

將愛德華菌接種到配制的營養(yǎng)培養(yǎng)基上面進(jìn)行37℃恒溫震蕩培養(yǎng)15小時(shí)。

2.2腹腔注射活菌的免疫反應(yīng)

將培養(yǎng)所得的菌懸液注射到牙鲆魚的腹腔進(jìn)行免疫。然后將人工感染的牙鲆魚單獨(dú)放在循環(huán)水族箱中培養(yǎng)，并在之后的0d-7d的每天同一時(shí)間取魚的頭腎組織器官進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3RNA抽提

采用QIAGE公司試劑盒進(jìn)行總RNA的提取。得到樣品后，采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA純度的鑒定。純度鑒定主要是根據(jù)在兩個(gè)不同波長下的光吸收值的比值大小來決定，即OD260OD280的比值。[2]

2.4cDNA第一鏈的合成

根據(jù)QIAGE試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)操作。

2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

3結(jié)果

3.1總RNA檢測(cè)

根據(jù)結(jié)果計(jì)算，RNA的OD260OD280在1.80-2.05之間，說明本次試驗(yàn)提取的RNA的質(zhì)量很高。

3.2MyD-88、IL-1和TNF三基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算

時(shí)間0d1d2d3d4d5d6d

MyD-8810.410.540.730.141.890.69

IL-110.460.750.330.170.341.72

TNF1290.02503.2546.8531.78582.05119.02

按照生物統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)誤差原理計(jì)算（P<0.05，n=3），并觀察得到如下結(jié)果：

①M(fèi)yD-88基因的表達(dá)量在0d至1d慢慢下降，1d至3d緩慢上升，3d至4d急速下降，4d時(shí)達(dá)最低值，4d至5d急速上升，5d時(shí)達(dá)到最大值，5d至7d緩慢下降。

②TNF基因的表達(dá)產(chǎn)物在0d至1d時(shí)緩慢下降，1d至2d緩慢上升，2d至4d急速下降，4d時(shí)達(dá)最低值，4d至6d急速上升，6d時(shí)達(dá)到最大值，6d至7d緩慢下降。

③IL-1基因的表達(dá)產(chǎn)物在0d至3d緩慢上升，3d至4d則急速下降，至最低值，4d至5d則急速上升，在5d時(shí)達(dá)到最大值，后5d至6d緩慢上升，同樣在最后一天再次慢慢回降。

3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)結(jié)果可知，RT-PCR產(chǎn)物的Tm值（基因表達(dá)水平）在79至86范圍內(nèi)，且82至84之間居多，故產(chǎn)物不是引物二聚體。

4結(jié)論

通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，溶解曲線及CT值的分析，可見MyD-88、TNF、IL-1三基因均參與了免疫反應(yīng)。牙鲆在感染愛德華菌后隨著時(shí)間的推移，基因表達(dá)的產(chǎn)物量也隨之有所變化，具體表現(xiàn)為在不同的時(shí)間內(nèi)變化的大小不同。該結(jié)論為尋找和開發(fā)療牙鲆疾病免疫新技術(shù)提供一定的可行性。

5討論

硬骨魚類雖然屬于最原始的一種脊椎動(dòng)物，但他們的免疫系統(tǒng)卻和哺乳動(dòng)物相似，同樣具有天然性免疫和適應(yīng)性免疫。[3]當(dāng)機(jī)體外層防御因感染而被破壞時(shí)，將會(huì)出現(xiàn)天然免疫，此過程伴隨著一系列受細(xì)胞因子影響的細(xì)胞和介質(zhì)的參與變化。然而Toll受體又是天然免疫系統(tǒng)中一個(gè)重要的通路，故研究Toll受體信號(hào)通路及免疫過程中相關(guān)細(xì)胞因子的變化，進(jìn)而可加深對(duì)天然免疫過程的了解。

牙鲆是我國近岸海水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)魚類之一，但由于高密度集約化養(yǎng)殖，魚類疾病對(duì)此影響日趨嚴(yán)重。愛德華菌病是影響魚類健康的致病菌之一，我們通過了解魚類免疫系統(tǒng)及相關(guān)過程中細(xì)胞因子的變化，可更早的找到適合的方法改善這一問題。也可進(jìn)一步保護(hù)我們的生態(tài)環(huán)境，為開發(fā)魚類免疫藥物提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]唐玫，馬廣智，徐軍.2002魚類免疫學(xué)研究進(jìn)展[J].免疫學(xué)雜志，2002，18（3）：113-116.

[2]吳戀，孫金生，耿緒云，潘寶平，魏俊利，王雪慧，高虹.牙鲆Toll樣受體1基因全長cDNA的克隆及特征分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012.40（26）：12754-12755.

[3]邱麗華，張漢華，吳進(jìn)鋒.魚類腫瘤因子基因和手提的研究進(jìn)展[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2004，9，11（5）：482-287.

作者簡介：孫亞婷（1990-），女，漢族，天津武清人，研究方向：免疫。