雞傳染性支氣管炎病毒Real-Time PCR檢測方法的建立

張會 趙魯 連銳銳 張子越 趙曉月 潘力 李智勇

摘? 要：本試驗針對腎型雞傳染性支氣管炎病毒（IBV-QX）保守基因N基因設(shè)計并合成引物，構(gòu)建了陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品;經(jīng)過不斷優(yōu)化建立了檢測IBV-QX SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，本次所建立的檢測方法重復(fù)性好，特異性高，最低可檢測到39.7copies/μl的病毒核酸，對常見禽源病毒無交叉反應(yīng)。本次建立的方法不僅可以用于各基因型IBV病原檢測，也可用于病毒的定量研究。因此，本實驗室所建立的IBV檢測方法在雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測上具有重要意義。

關(guān)鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒;Real-Time PCR;病毒檢測;熒光定量

中圖分類號：S858.31? ? ?文獻標(biāo)識碼：B? ? ?文章編號：1673-1085（2019）2-0020-04

傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的高度接觸傳染性疾病，IBV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬。IBV感染主要引起雞的呼吸道、腎臟和生殖道病理變化，導(dǎo)致被感染雞群發(fā)病而造成巨大經(jīng)濟損失[1]。IBV的不同血清型之間幾乎沒有交叉保護，不斷出現(xiàn)新的IBV血清型是預(yù)防和控制IB的主要挑戰(zhàn)[2]。調(diào)查顯示，QX基因型IBV是我國近幾年主要流行的毒株之一[3]，常規(guī)RT-PCR方法以其簡單、快捷的特點被各實驗室用作IBV的實驗室診斷方法，但該方法不能用于IBV的定量檢測，并且對病毒含量很低的病料也不能夠很好地檢出。為此，建立一種特異性高、重復(fù)性好、敏感性高的IBV實驗室檢測方法將有助于雞傳染性支氣管炎疫情的防控，從而將損失將至最低。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 病毒株? IBV-QX毒株由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所山東省禽病診斷與免疫重點實驗室惠贈。

1.1.2? 試驗動物? 9日齡 SPF雞胚購自山東昊泰實驗動物繁育有限公司，用于病毒復(fù)蘇。

1.1.3? 試驗試劑與主要試驗儀器? 瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒、體液病毒DNA/RNA提取試劑盒購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司;熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄體系試劑購自山東賽恩斯科技有限公司;DL-2000Marker、2xTaq PCR Star Mix、感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體、質(zhì)粒小提試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀均購自杭州博日科技有限公司;Real-Time PCR儀（LightCycler 96）購自德國羅氏診斷有限公司;紫外凝膠成像儀（Alpha Imager HP）購自美國Protein Simple公司;干式恒溫器、紫外透射反射分析儀、自動核酸提取儀購自西安天隆科技有限公司;超微量分光光度計（K5600）購自南京旭析儀器有限公司。

1.2? 試驗方法

1.2.1? SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR引物的設(shè)計與陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備? 根據(jù)IBV-QX的N基因序列（GenBank 中登錄號為AY761141.1）。利用primer premier6.0軟件設(shè)計了引物。引物：上游5'-GTA GCC TGG AAA CGA ACG G -3'，下游，5'-TCC TAG TGC TGT ACC CTC GG -3'，片段大小186bp，引物由青島英賽特生物科技有限公司合成。采用TaKaRa公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提核酸反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系20μl，1μl通用引物（50 pmol/μl）、4μl模板，其他反轉(zhuǎn)錄成分按照試劑盒說明使用;反轉(zhuǎn)錄條件：25℃ 5min，42℃ 60min，70℃ 5min。將獲得的cDNA進行常規(guī) PCR擴增。PCR反應(yīng)體系25μl，上、下游引物各0.4μl（20 pmol/μl），2μl模板，用ddH2O補至25μl，其他成分按照說明書加入。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 2min;變性95℃ 30s;退火55℃ 30s;延伸72℃ 45s;共33個循環(huán);重延伸72℃ 10min。將PCR產(chǎn)物進行電泳，按照瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒說明回收目的片段，將回收的目的基因連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，過夜培養(yǎng)，挑單菌落，進行陽性鑒定，將陽性單菌落搖菌提質(zhì)粒，并將所提質(zhì)粒送生物公司測序。

1.2.2? IBV-M41 SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立? 采用超微量分光光度計（K5600）測定所提質(zhì)粒濃度。根據(jù)相關(guān)公式計算其相應(yīng)拷貝數(shù)[4]。將所得質(zhì)粒梯度稀釋后按照以下體系與反應(yīng)條件：反應(yīng)體系為20μl，Mix 10μl、ddH2O 7.2μl、上、下游引物各0.4μl、模板2μl。預(yù)變性95℃ 120s;變性95℃ 15s;退火55℃15s;延伸72℃ 25s;溶解曲線跟隨儀器自設(shè)系統(tǒng)，45個循環(huán)，設(shè)置三個空白對照，儀器自動采集熒光信號，空白對照為陰性時，結(jié)果可信。

1.2.3? 敏感性試驗? 將IBV-QX的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進行10倍梯度稀釋，稀釋至測定熒光定量PCR儀所能檢出的最低濃度，并同時進行普通PCR方法檢測，比較二者的敏感性。

1.2.4? 特異性試驗? 取H9N2亞型禽流病毒（AIV-H9N2）、禽偏肺病毒（APV）、雞傳染性貧血病毒（CAV）、新城疫病毒（NDV）、傳染性法氏囊病毒（IBDV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、雞毒支原體（MG）、禽白血病病毒（ALV）和IBV-QX的cDNA按本試驗優(yōu)化好的方法同時進行Real-Time PCR檢測，以檢驗所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的特異性。

1.2.5? 重復(fù)性試驗? 批間重復(fù)性試驗： 取6個10倍梯度稀釋的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在同一條件下進行3次獨立的Real-Time PCR檢測。

批內(nèi)重復(fù)性試驗：取6個10倍梯度稀釋的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，每個梯度3個重復(fù)，進行Real-Time PCR檢測。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 普通PCR鑒定重組質(zhì)粒結(jié)果? 將構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進行普通PCR擴增、電泳，目的核酸片段大小為186bp。見圖1。

2.2? 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立與其靈敏度和特異性驗證結(jié)果

2.2.1? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏度? 此次Real-Time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線最低可檢測到39.7copies/μl的病毒cDNA，比普通RT-PCR靈敏度高出100倍，目的核酸片段大小為186bp。結(jié)果見圖2。

2.2.2? 擴增曲線的重復(fù)性? 由結(jié)果統(tǒng)計分析得出，批間變異系數(shù)（CV）小于1.5%，批內(nèi)變異系數(shù)（CV）小于0.6%，重復(fù)性良好，符合試驗要求。結(jié)果見圖3。

2.2.3? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的特異性? 所取AIV-H9N2、APV、CAV、NDV、IBDV、ILTV、MG、ALV和IBV-QX的核酸按本試驗優(yōu)化好的方法同時進行Real-Time PCR檢測，除了IBV-QX外的其它病毒cDNA 對應(yīng)孔均未出現(xiàn)熔解曲線，證明本次建立的Real-Time PCR檢測方法的特異性強，符合試驗要求。結(jié)果見圖4。

2.2.4? 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)? 測得質(zhì)粒濃度為：128ng/μl，OD260/230=2.53，OD260/280=1.80，計算得出其原始拷貝數(shù)為3.97×1010copies/μl;不斷優(yōu)化試驗方法后建立了對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-3.7924x+38.32，R2=1.0，Efficiency=2.01，Error=0.35，各項數(shù)據(jù)均符合試驗要求。

3? 討論

最新流調(diào)表明，目前QX基因型IBV已占我國流行毒株的70%左右，由于RNA聚合酶缺乏校正能力，使得IBV極易發(fā)生變異，新的血清型和基因型不斷出現(xiàn)，不同毒株之間免疫交叉保護并不理想[5-6]?；谝陨峡陀^原因，本實驗室經(jīng)過不斷優(yōu)化試驗條件，建立了IBV SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR的檢測方法，通過以上試驗結(jié)果可以得出：與傳統(tǒng)RT-PCR檢測方法相比，Real-Time PCR法靈敏度更高，這對養(yǎng)殖場早期雞傳染性支氣管炎病毒的防控具有重要意義，同時，本實驗室根據(jù)IBV保守基因設(shè)計引物而建立的檢測方法，可用于不同基因型、血清型的IBV病毒定量檢測和被感染動物相關(guān)器官病毒載量研究。

參考文獻：

[1]? Cook J K， Jack wood M， Jones R C. The long view：40 years of infectious bronchitis research.[J]. Avian Pathology， 2012， 41（3）：239-250.

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[4]? 劉喬然，劉勝旺.雞傳染性支氣管炎病毒Real-time PCR方法的建立及其對感染雞體內(nèi)病毒的檢測[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2008，30（8）：36-41.

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