不同地區(qū)橡膠樹紅根病菌的生物學(xué)特性及室內(nèi)毒力測定

賀春萍 李銳 梁艷瓊 吳偉懷 黃興 習(xí)金根

摘? 要? 橡膠樹紅根病是我國分布最廣、危害最重的橡膠樹根部病害。為明確我國海南和云南地區(qū)橡膠紅根病菌的生物學(xué)特性及對殺菌劑的敏感性，采用十字交叉法研究了不同培養(yǎng)條件對病菌菌絲生長的影響，并測定了10種不同殺菌劑對病菌的抑制作用。結(jié)果表明，病原菌在玉米+橡膠根的培養(yǎng)基上生長最快，對溫度、pH等適應(yīng)范圍廣，溫度在13～31 ℃，pH在3～10均能生長，最適生長溫度為28 ℃，多數(shù)菌株最佳pH為7～9，且能利用多種碳氮源;不同的碳源中，果糖、半乳糖、麥芽糖、葡萄糖和甘露糖較適合該菌的生長;在供試氮源中，菌絲在酪氨酸、牛肉浸膏的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長最快，在色氨酸和尿素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長最慢;光照對病菌有抑制作用，黑暗有利于菌絲生長;菌絲的致死溫度為47 ℃，10 min。不同地區(qū)的病原菌株間藥劑敏感性存在一定差異，戊唑醇抑菌效果最好，其EC50為0.0312 μg/mL，其次為嘧菌酯、十三嗎啉、咪鮮胺和腈菌唑，EC50分別為0.5581、0.6759、1.3763和1.5603 μg/mL。

關(guān)鍵詞? 橡膠樹紅根病;橡膠靈芝菌;生物學(xué)特性;室內(nèi)毒力

中圖分類號? S763.7? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

橡膠樹紅根病是我國分布最廣、發(fā)病率最高、危害最為嚴(yán)重的橡膠樹根部病害，其病原菌具潛伏期長[1]、寄主范圍廣[2]、在土壤中蔓延迅速[3]和防治困難的特點(diǎn)，致使干膠產(chǎn)量損失嚴(yán)重和樹體死亡。據(jù)調(diào)查，橡膠樹紅根病發(fā)病率為10%～40%，若發(fā)病未及時(shí)處理，死亡率可達(dá)100%[4]。該病害是限制我國橡膠單產(chǎn)提高的重要生物因子，近年來危害有愈加嚴(yán)重的趨勢。1931年，Corner[5]將橡膠樹紅根病菌鑒定為橡膠樹靈芝 [Ganoderma pseudoferreum （Wakef） Over. et Stei n -

m];張運(yùn)強(qiáng)等[6-7]、彭軍等[8]研究表明我國橡膠樹

紅根病菌有2個(gè)種群，分別為G. philippii（與G. pseudoferreum是同物異名）和G. gibbosum。當(dāng)前防治橡膠樹紅根病主要采用十三嗎啉[9-11]灌根，該藥劑雖防效不錯(cuò)，但價(jià)格昂貴，長期使用出現(xiàn)防效下降現(xiàn)象[11]。為尋找高效、低成本防治藥劑，李四有等[12]開展了8種殺菌劑對病原菌的毒力測定，藍(lán)志南等[13]采用百枯凈和蟲線清、何其光等[14]通過丙環(huán)唑與三唑酮混配藥劑進(jìn)行橡膠樹紅根病的田間防治試驗(yàn)，黃雅志等[15]、余卓桐等[16]等對該病害的防治措施亦開展了研究。由于橡膠樹紅根病菌存在不同的種和變種，明確不同地區(qū)病原菌的生物學(xué)特性及其對不同殺菌劑的敏感性，對生產(chǎn)上指導(dǎo)該病害的防控意義重大。2008年，張賀等[17]對橡膠樹紅根病菌生物學(xué)特性進(jìn)行研究，但研究僅限于一株橡膠樹紅根病菌的生物學(xué)特性，而對其他省和地區(qū)的橡膠樹紅根病菌缺乏系統(tǒng)的生物學(xué)研究。除張賀的研究外亦未見其他關(guān)于該病病原菌生物學(xué)特性方面的研究報(bào)道。為此，本文對采自海南省和云南省不同地理環(huán)境的6株橡膠樹紅根病菌菌株進(jìn)行生物學(xué)特性研究，分析比較不同來源的病原菌株間生物學(xué)特性的差異，同時(shí)測定10種殺菌劑對不同地區(qū)、不同種群的2株病原菌的抑菌能力，為有效防治該病害提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試病原菌：橡膠樹紅根病菌菌株Gp002、Gp010和Gp013分別采自云南省景洪市、河口縣螞蟥堡農(nóng)場和紅河州，Gp038、Gp040和Gp044分別采自海南中坤農(nóng)場、中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場和海南儋州蘭洋農(nóng)場，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所分離、鑒定與保存。其中菌株Gp010為G. gibbosum 種群，其余菌株為G. philippii種群。

培養(yǎng)基：橡膠根汁培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基（CMA）、CMA+橡膠根汁培養(yǎng)基[18]、PSA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PDA+酵母培養(yǎng)基、PDA+酵母橡膠根汁培養(yǎng)基、面粉培養(yǎng)基（FA）、FA+橡膠根汁培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基（OA）、OA+橡膠樹根汁培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方參考賀春萍等[19]。

供試殺菌劑：在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定各藥劑最低抑制質(zhì)量的濃度，配制6個(gè)質(zhì)量濃度梯度的含藥PDA培養(yǎng)基平板。殺菌劑種類、廠家及供試濃度見表1。

1.2? 方法

1.2.1? 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響? 將純化的病原菌制成直徑為7 mm的菌餅，分別接種于1.1的供試培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌絲生長狀況。7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)4次。

1.2.2? 溫度對病原菌菌絲生長的影響? 將純化的病原菌制成直徑為7 mm的菌餅，接種于PDA培養(yǎng)基上，分別置于5、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37和40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌絲生長情況。7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)4次。

1.2.3? pH對病原菌菌絲生長的影響? 用滅菌NaOH（1 mol/L）和HCl（1 mol/L）將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。然后采用1.2.2節(jié)中的方法接種和測量菌落直徑。每處理重復(fù)5次，連續(xù)測量7 d。計(jì)算其菌落平均生長直徑。

1.2.4? 光照對病原菌菌絲生長的影響? 從菌落邊緣取直徑為7 mm菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，分別置于24 h光照（日光燈，18 W）、光暗交替

1.2.5? 碳源、氮源對病原菌菌絲生長的影響? 參照賀春萍等[19]的方法，測定12種碳源和13種氮源對不同地區(qū)橡膠樹紅根病菌菌株生長的影響。每處理重復(fù)4次。28 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)至7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.6? 致死溫度測定? 取滅菌具塞玻璃試管，分別置于40、45、47、49、51、53、55 ℃恒溫水浴鍋中，當(dāng)試管內(nèi)溫度達(dá)到設(shè)定溫度值時(shí)，加入2 mL菌絲懸浮液水浴10 min，室溫中放置未水浴的試管作對照，每處理重復(fù)4次。后取經(jīng)過處理的菌絲懸浮液0.2 mL在PDA培養(yǎng)基上涂勻，28 ℃培養(yǎng)。168 h后觀察有無菌落生長。詳情參考賀春萍等[19]方法。

1.2.7? 殺菌劑對病原菌菌絲生長的影響? 參照賀春萍等[20]的方法，配置6個(gè)不同濃度梯度的供試藥液，制作系列濃度的含藥平板。選取在PDA平板上培養(yǎng)7～14 d的代表性菌株Gp010（云南）和Gp038（海南），從菌落邊緣取直徑7 mm的菌餅接種于含藥PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7～14 d，測量菌落直徑，并計(jì)算抑制率。每處理重復(fù)5次。

1.3? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SAS 8.02軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，差異顯著性采用Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

培養(yǎng)基對不同菌株生長有顯著影響（表2）。供試的2株病菌在12種不同培養(yǎng)基上均能生長，不同菌株在不同培養(yǎng)基上的生長速率有所差異。菌株Gp010最適培養(yǎng)基為OA+橡膠樹根汁和CMA+橡膠樹根汁，培養(yǎng)7 d菌落直徑分別為5.25 cm和5.15 cm;菌株Gp038最適培養(yǎng)基為CMA和CMA+橡膠樹根汁，培養(yǎng)7 d菌落直徑分別為4.31 cm和4.28 cm。

2.2? 溫度對菌絲生長的影響

在PDA平板上，供試的6株菌株在10 ℃以下和37 ℃以上條件下都停止生長，13～31 ℃溫度下均能生長;除Gp010最適生長溫度為31 ℃外，其余5株病原菌的最適生長溫度均為28 ℃（表3）。除Gp010在34 ℃條件下還能少許生長外，其余5株供試病原菌在34 ℃時(shí)菌絲都不能生長。另外，在不同溫度下各菌株生長情況略有差異，以菌株Gp010的菌落生長最快。

2.3? pH對菌絲生長的影響

不同pH條件下病菌菌絲生長速率測定結(jié)果表明，各菌株在pH 3～10的范圍內(nèi)均能生長;在不同pH條件下，菌株生長速率存在一定差異（表4）。菌株Gp038和Gp044的最適生長pH為9，菌株Gp013的最適生長pH為8，菌株Gp040的最適生長pH為4，菌株Gp010的最適生長pH范圍最寬為7～10，菌株Gp002的最適生長pH為6～7。

2.4? 光照對菌絲生長的影響

在持續(xù)光照、光暗交替和完全黑暗3種條件下病菌均能生長，且供試菌株的菌絲生長速率各不相同（表5）。所有參試的病菌菌絲在無光條件下生長速率明顯比有光條件下快，完全黑暗條件最適合紅根病菌菌絲的生長。

2.5? 碳、氮源對菌絲生長的影響

碳源對不同菌株生長有顯著影響，菌株間對不同碳源的利用差異較大（表6）。在供試的12種碳源中，菌株Gp002以半乳糖、麥芽糖、山梨糖、蔗糖、可溶性淀粉和葡萄糖為最佳碳源，菌株Gp013以半乳糖和麥芽糖為最佳碳源，菌株Gp010和Gp040以果糖為最佳碳源，菌株Gp044以甘露糖為最佳碳源，而菌株Gp038以葡萄糖、乳糖、麥芽糖、半乳糖、鼠李糖、蔗糖、木糖、甘油為最佳碳源。

氮源對不同菌株生長的影響顯著（表7）。菌株Gp002和Gp038以酪氨酸為最佳氮源，菌株Gp013和Gp040以牛肉浸膏為最佳氮源，菌株Gp010以蛋白胨、牛肉浸膏、酪氨酸、丙氨酸、酵母浸膏、甘氨酸和胱氨酸為最佳氮源，而菌株Gp044則以牛肉浸膏、蛋白胨和酵母浸膏為最佳氨源。各供試菌株在其余幾種氮源間菌絲生長存在較大差異，其中硝酸鈉、氯化銨、色氨酸和尿氨酸的利用率最差。

2.6? 致死溫度測定

參試病菌菌絲在40 ℃、45 ℃恒溫水浴10 min，菌絲仍能生長，但在≥47 ℃恒溫水浴10 min后菌絲不能生長。說明參試的6株橡膠樹紅根病菌菌絲的致死溫度為47 ℃（10 min）。

2.7? 殺菌劑對菌絲生長的影響

2.7.1? 殺菌劑對橡膠樹紅根病菌EC50值的比較分析? 供試殺菌劑對來自海南和云南地區(qū)不同種群的2株橡膠樹紅根病菌的菌絲生長抑制作用差異較大（表8）。各藥劑對病菌的毒力測定結(jié)果表明，戊唑醇、嘧菌酯、十三嗎啉、咪鮮胺和腈菌唑5種藥劑對病菌具有顯著抑制作用，其平均EC50值均小于2 μg/mL，分別為0.0312 μg/mL、0.5581 μg/mL、0.6759 μg/mL、1.3763 μg/mL和1.5603 μg/mL;三唑酮、百菌清和異菌脲對紅根病菌也有較強(qiáng)的抑制作用，平均EC50值分別為4.1727 μg/mL、4.2787 μg/mL和4.8868 μg/mL。抑霉唑和甲基托布津的抑制作用相對較弱，其平均EC50值分別為14.1650 μg/mL和18.9393 μg/mL。2.7.2? 橡膠樹紅根病菌對殺菌劑的敏感性分析? ?由表8可知，10種藥劑對2株橡膠樹紅根病菌的斜率值均不相同，2株紅根病菌菌株的斜率范圍在0.5362～8.4468，其中十三嗎啉、咪鮮胺、抑霉唑和嘧菌酯的平均斜率值分別為0.7832、0.9241、0.8442和0.9578，而其余6種藥劑的平均斜率值均大于1。10種供試藥劑斜率值最大差異范圍為1.2234～4.1016倍，表明來源不同的菌株對相同藥劑的敏感性亦存在較大差異。

3? 討論

紅根病是橡膠樹最重要的根部病害，目前已成為阻礙橡膠產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要生物限制因素。研究發(fā)現(xiàn)我國橡膠樹紅根病菌有2個(gè)種群（G. philippii和G. gibbosum）[6-8]，明確橡膠樹紅根病菌的生物學(xué)特性以及測定不同殺菌劑對病菌的室內(nèi)毒力，對生產(chǎn)上指導(dǎo)該病害的防控意義重大。

本文通過對云南、海南兩省的橡膠樹紅根病菌生物學(xué)特性研究表明，紅根病菌對pH適應(yīng)范圍廣，pH 3～10范圍內(nèi)均能生長，云南地區(qū)橡膠紅根病菌在pH為6～9時(shí)，菌絲生長較好，說明云南菌株對堿性環(huán)境的適應(yīng)性較好;海南地區(qū)橡膠紅根病菌菌株Gp038和Gp044在pH為7～9，而菌株Gp040 pH為3～5時(shí)，菌絲生長較好，海南菌株多數(shù)對堿性環(huán)境適應(yīng)性較好。以上研究結(jié)果與張賀等[17]報(bào)道的病菌菌絲在pH為4～8范圍內(nèi)均能生長、最適生長pH為6～7有些差異，這可能與不同地區(qū)的酸堿土質(zhì)有較大關(guān)系，是造成兩省菌株差異的主要原因。張賀等[17]研究表明，紅根病病菌菌絲的致死溫度為62 ℃（10 min），而本研究表明海南、云南地區(qū)病原菌的致死溫度為47 ℃（10 min），這可能與不同地區(qū)的病原菌對熱的忍耐程度不同有關(guān)系。

通過溫度試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，橡膠樹紅根病菌對溫度的適應(yīng)范圍廣，溫度在13～31 ℃均能生長，除云南地區(qū)紅根病菌菌株Gp010最適生長溫度為31 ℃外，其余5個(gè)菌株最適生長溫度均為28 ℃;在不同溫度下各地區(qū)菌株菌落直徑差異較大，其中菌株Gp010菌落生長最快，菌絲生長較均一，且菌落較圓。以上研究與張賀等[17]的報(bào)道基本一致，張賀等對橡膠樹紅根病菌生物學(xué)特性的研究表明，該病病原菌的最適生長溫度為28 ℃，而本研究表明不同種群的紅根病菌最適生長溫度有差異，G. gibbosum種群菌株Gp010最適溫度為31 ℃，而G. philippii種群的其余5株供試菌的最適溫度為28 ℃。菌株對不同碳源的利用程度各異，果糖、半乳糖、麥芽糖、葡萄糖和甘露糖適合該菌的生長。不同氮源對菌株生長有顯著影響，以牛肉浸膏、酪氨酸對菌株生長促進(jìn)作用最大，而在色氨酸和尿氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長最慢。

目前，化學(xué)防治仍然是橡膠樹根病綜合防治的重要措施。殺菌劑室內(nèi)毒力測定中EC50值越小、斜率越大，表明病菌對藥劑的敏感性越大。本研究以10種供試藥劑對不同地區(qū)和種群的2株橡膠樹紅根病菌菌絲體生長的EC50值和毒力回歸方程斜率的分析發(fā)現(xiàn)，戊唑醇、嘧菌酯、十三嗎啉、咪鮮胺和腈菌唑5種藥劑對橡膠樹紅根病菌的平均EC50值在0.0312～1.5603 μg/mL之間，表明這5種藥劑對橡膠樹紅根病菌的抑菌效果較好。其中十三嗎啉和咪鮮胺的斜率值稍小，這可能與它們長期用于防治橡膠根病、白粉病和炭疽病有關(guān)。在參試的10種藥劑中甲基托布津斜率最大，但其EC50值也最大，抑菌活性較小;抑霉唑和甲基托布津這兩種藥劑的抑菌效果相對較差。本文采用農(nóng)藥原藥進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，研究結(jié)果較客觀、準(zhǔn)確，研究結(jié)果與李四有等[12]研究結(jié)果相似，其中三唑類殺菌劑、十三嗎啉、咪鮮胺等藥劑對橡膠樹紅根病菌具較強(qiáng)的抑制作用。本研究篩選出的戊唑醇、嘧菌酯、咪鮮胺、腈菌唑等殺菌劑有望作為十三嗎啉的替代藥劑應(yīng)用于橡膠樹紅根病的防治。

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