油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)小白菜初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)

曹璐 付影 于旭東 蔡澤坪 羅佳佳 湯竹

摘? 要? 油菜素內(nèi)酯（Brassinolide，BL）能誘導(dǎo)單子葉植物初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)，而在雙子葉植物中還未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)外源施加不同濃度2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-Epibrassinolide，2，4-eBL）觀察小白菜（Brassica chinensis L.）初生根生長(zhǎng)狀況。結(jié)果表明：2，4-eBL能誘導(dǎo)小白菜初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)形成卷曲。隨著2，4-eBL濃度的升高，根卷曲比例和曲率逐漸增大，同時(shí)向地性逐漸降低。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源施加2，4-eBL可誘導(dǎo)雙子葉植物根不對(duì)稱生長(zhǎng)的現(xiàn)象，為研究油菜素甾醇（Brassinosteroids，BRs）在根生長(zhǎng)發(fā)育中的作用提供新途徑。

關(guān)鍵詞? 2，4-表油菜素內(nèi)酯;小白菜;初生根;不對(duì)稱生長(zhǎng);向地性

中圖分類號(hào)? Q945.32? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

1979年Grove等[1]首次從歐洲油菜（Brassica napus L.）花粉中分離出油菜素內(nèi)酯（Brassinolide， BL），至今已分離鑒定出70多種多羥基甾醇衍生物，統(tǒng)稱油菜素甾醇（Brassinosteroids， BRs）[2]。在所有BRs中BL的生物活性最高[3-4]。BRs在根中合成并調(diào)控根的生長(zhǎng)發(fā)育，影響根的伸長(zhǎng)、不定根發(fā)生、側(cè)根發(fā)育、根毛形成、根尖重力反應(yīng)等[5-9]。

BRs在植物體各器官中的分布存在顯著差異，尤其在根中的含量甚微，從而導(dǎo)致其在根中的發(fā)現(xiàn)晚于下胚軸及植物體的其它部位。與此對(duì)應(yīng)的是，根對(duì)BRs的反應(yīng)要比植物體的其他部位敏感得多[10]。BRs最早的分離提純來(lái)自于玉米（Zea mays），隨后相繼在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、豌豆（Pisum sativum）和西紅柿（Lycopersicon esculentum）的根中被發(fā)現(xiàn)[11-13]。研究證明BRs在調(diào)控根端分生組織（root apical meristem，RAM）分化以及根伸長(zhǎng)的過(guò)程中扮演著重要角色[14]。在擬南芥中，BRs在極低濃度下（≤0.1 nmol/L）促進(jìn)根的伸長(zhǎng)[10]，而在高濃度下（≥10 nmol/L）抑制[15-17]。BRs合成或信號(hào)受阻均會(huì)導(dǎo)致RAM變小和根長(zhǎng)縮短[18]。BRs還在影響根的向地性上起關(guān)鍵作用，Soochul等[19]和Kim等[20]發(fā)現(xiàn)BRs可以增加玉米、擬南芥等不同物種主根的向地性曲率。在玉米中，當(dāng)BL濃度為107 mol/L時(shí)向地性角度達(dá)到最大值;而在擬南芥中，當(dāng)BL濃度為10?10～10?7 mol/L時(shí)，根向地性逐漸增強(qiáng)。

雙子葉和單子葉植物根存在一定區(qū)別。其中，大多雙子葉植物根為定根、根系為直根系，而單子葉植物根為不定根、根系為須根系[21]。BRs能夠誘導(dǎo)單子葉須根系植物水稻（Oryza sativa）幼苗初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)形成卷曲（coiling）和波浪形彎曲（wave）[22-24]。然而，關(guān)于BRs誘導(dǎo)雙子葉直根系植物初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)的研究還未見報(bào)道。本研究用2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4- Epibrassinolide，2，4-eBL）處理雙子葉直根系植物小白菜（Brassica chinensis L.），探究2，4-eBL調(diào)控小白菜根不對(duì)稱生長(zhǎng)、減弱初生根向地性的現(xiàn)象，為植物激素對(duì)根生長(zhǎng)的研究提供新的見解。

1? 材料與方法

1.1? 材料

小白菜（Brassica chinensis L.）種子購(gòu)自蔬菜物資公司，商品名稱為綠領(lǐng)四月慢。2，4-eBL（code E-1641）購(gòu)自sigma公司，用75%乙醇溶解并配制成1 mmol/L母液。

1.2? 方法

1.2.1? 種子滅菌? 選擇飽滿且不開裂的種子，自來(lái)水浸泡30 min，在超凈工作臺(tái)上依次用75%乙醇和0.1%升汞分別浸泡30 s和7 min，無(wú)菌水浸洗5遍。

1.2.2? 初生根向地性角度的測(cè)量? 在超凈工作臺(tái)上，將滅好菌的小白菜種子接入2，4-eBL濃度梯度分別為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L的MS固體培養(yǎng)基中。每只試管接種1粒種子，重復(fù)10次，并于第3天測(cè)量初生根的向地性角度。

1.2.3? 初生根主根長(zhǎng)、曲率和卷曲比例的測(cè)量? 在超凈工作臺(tái)上，將滅好菌的小白菜種子接入2，4-eBL濃度梯度分別為0、2×10?13、2×10?12、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L的MS固體培養(yǎng)基中。每瓶接種10粒種子，重復(fù)6次。第8 d測(cè)量主根長(zhǎng)、曲率和卷曲比例。

1.2.4? 培養(yǎng)條件? 以上均為光照和黑暗培養(yǎng)，光照培養(yǎng)條件為：溫度（25±2）℃，光強(qiáng)1000 lx，光周期為光照16 h/d，黑暗8 h/d;暗培養(yǎng)條件為：溫度（25±2）℃，黑暗24 h/d。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

根長(zhǎng)、曲率和向地性角度均采用Image J v1.50i軟件（https：//imagej.nih.gov/ij/index.html）測(cè)量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用LSD檢驗(yàn)和Duncan法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性多重比較。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 外源施加2，4-eBL對(duì)小白菜初生根向地性的影響

無(wú)論是光照培養(yǎng)還是暗培養(yǎng)，2，4-eBL對(duì)小白菜初生根向地性的作用2～3 d便能表現(xiàn)出來(lái)。濃度大于2×10?11 mol/L時(shí)，隨著2，4-eBL濃度的升高，根尖向地性角度減小（圖1A～圖1H）。光培養(yǎng)下，2，4-eBL濃度為0時(shí)，根尖向地性角度為（70.9±10.4）;濃度為2×10?11 mol/L時(shí)，根尖向地性角度與對(duì)照相比有顯著差異;濃度為2×10?9 mol/L時(shí)，根尖向地性角度與對(duì)照相比有極顯著差異;濃度為2×10?7 mol/L時(shí)，根尖向地性角度是對(duì)照的38.6%，有極顯著差異（圖1I）。暗培養(yǎng)下，2，4-eBL濃度為0時(shí)，根尖向地性角度為（74.4±10.6）。濃度為2×10?11 mol/L及以上時(shí)，根尖向地性角度與對(duì)照相比有極顯著差異;2，4-eBL濃度為2×10?7 mol/L時(shí)，根尖向地性角度是對(duì)照的43.5%（圖1J）。可見，2，4-eBL對(duì)小白菜初生根向地性有減弱作用。

2.2? 外源施加2，4-eBL對(duì)小白菜初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)的影響

無(wú)論是光照培養(yǎng)還是暗培養(yǎng)，外源施加2，4-eBL能誘導(dǎo)小白菜初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)形成卷曲。光培養(yǎng)下，2，4-eBL濃度為0時(shí)，初生根卷曲的曲率是（0.17±0.03）mm1，卷曲比例為（3.3± 2.9）%;當(dāng)濃度為2×1013 mol/L時(shí)，卷曲的比例為

A～D：光照培養(yǎng)3 d（A～D對(duì)應(yīng)2，4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L）;E～H：黑暗培養(yǎng)3 d（E～H對(duì)應(yīng)2，4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L）;I：光培養(yǎng)3 d初生根向地性角度;J：暗培養(yǎng)3 d初生根向地性角度;

比例尺：1 cm。*表示與對(duì)照相比存在顯著差異（p<0.05）;**表示與對(duì)照相比存在極顯著差異（p<0.01）。

（12.97±3.23）%，是對(duì)照的3.89倍，具有極顯著差異（p<0.01）。對(duì)于初生根卷曲曲率而言，當(dāng)濃度小于2×10?10 mol/L時(shí)，初生根卷曲曲率隨著2，4-eBL濃度的升高緩慢上升，當(dāng)濃度大于2×10?10 mol/L時(shí)，初生根卷曲曲率隨著2，4-eBL濃度的升高迅速上升。對(duì)于初生根卷曲比例而言，當(dāng)濃度小于2×10?9 mol/L時(shí)，初生根卷曲比例隨著2，4-eBL濃度的升高緩慢上升，當(dāng)濃度大于2×10?9 mol/L時(shí)，初生根卷曲比例隨著2，4-eBL濃度的升高迅速上升;當(dāng)濃度為2×10?7 mol/L時(shí)卷曲的曲率和比例達(dá)到最大值，分別為（0.65± 0.06）mm1和（95±5）%，是對(duì)照的3.82和28.53倍（圖2A～圖2F、圖3C、圖3E）。暗培養(yǎng)下，2，4-eBL濃度為0時(shí)，初生根卷曲的曲率是（0.20±0.04）mm1，卷曲比例為（3.7±3.2）%;2，4-eBL濃度為2×10?10 mol/L時(shí)，根卷曲的曲率為（0.24± 0.04）mm1，是對(duì)照的1.2倍，差異顯著（p<0.05）;而卷曲比例為（24.57±1.87）%，是對(duì)照的6.59倍，差異極顯著;當(dāng)濃度小于2×10?9 mol/L時(shí)，初生根卷曲曲率和卷曲比例隨著2，4-eBL濃度的升高緩慢上升，當(dāng)濃度大于2×10?9 mol/L時(shí)，初生根卷曲曲率和卷曲比例隨著2，4-eBL濃度的升高迅速上升;濃度為2×10?7 mol/L時(shí)卷曲的曲率和比例達(dá)到最大值，分別為（0.76±0.14）mm1和（98.23± 3.01）%，是對(duì)照的3.80和26.34倍，有極顯著差異（圖2G～圖2L、圖3D、圖3F）。

2，4-eBL對(duì)小白菜幼苗初生根長(zhǎng)度也具有一定的影響。光培養(yǎng)下，2，4-eBL濃度為0時(shí)，初生根長(zhǎng)為（55.2±17.9）mm;當(dāng)濃度為2×10?7 mol/L時(shí)，初生根長(zhǎng)為（23.63±11.39）mm，是對(duì)照的42.8%，根長(zhǎng)明顯縮短，差異極顯著（圖3A）。暗培養(yǎng)下，2，4-eBL濃度為0時(shí)，初生根長(zhǎng)為（67.1±17.7）mm;2，4-eBL濃度為2×10?13 mol/L時(shí)，初生根長(zhǎng)為（94.26±27.82）mm，是對(duì)照的1.4倍，差異顯著;濃度為2×10?12 mol/L時(shí)，初生根長(zhǎng)為（87.35± 15.13）mm，是對(duì)照的1.3倍，差異極顯著;濃度為2×10?8～2×10?7 mol/L時(shí)，初生根長(zhǎng)分別為（50.47±7.57）mm和（37.86±11.68）mm，是對(duì)照的75.2%和56.4%，差異均極顯著（圖3B）。濃度相同的2，4-eBL暗培養(yǎng)下初生根長(zhǎng)普遍大于光培養(yǎng)（圖3A、圖3B）?？梢姡?，4-eBL可誘導(dǎo)小白菜初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)以及能影響初生根的根長(zhǎng)。

3? 討論

BRs能夠影響植物的光形態(tài)建成[25]。為了探究光照是否參與了BRs導(dǎo)致的根不對(duì)稱生長(zhǎng)，本試驗(yàn)通過(guò)外源添加不同濃度2，4-eBL，分別在光暗2種培養(yǎng)條件下，觀察小白菜初生根生長(zhǎng)狀況。

當(dāng)2，4-eBL濃度為0時(shí)，小白菜主根也會(huì)出現(xiàn)極少量（<4%）卷曲現(xiàn)象。Mullen等[26]發(fā)現(xiàn)重力刺激和根的接觸刺激可以使擬南芥初生根發(fā)生卷曲或彎曲現(xiàn)象。Jiang等[27]發(fā)現(xiàn)水稻根接觸到培養(yǎng)瓶的底部時(shí)，主根會(huì)發(fā)生卷曲，如果培養(yǎng)瓶中

A～F： 光照培養(yǎng)8 d（A～F所對(duì)應(yīng)的2，4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L）;G～L：

黑暗培養(yǎng)8 d（G～L所對(duì)應(yīng)的2，4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L）。比例尺：1 cm。

的介質(zhì)足夠深以致主根不能接觸瓶底，主根不會(huì)發(fā)生卷曲。楊文等[23]發(fā)現(xiàn)接觸刺激可使2，4-eBL處理的水稻初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)的比例顯著上升。由此可見，接觸刺激對(duì)根的不對(duì)稱生長(zhǎng)具重要作用。

BRs能使單子葉植物初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)，楊文等[22]發(fā)現(xiàn)2，4-eBL能夠使水稻初生根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)形成卷曲和波浪形彎曲，當(dāng)2，4-eBL濃度為2×10?13～2×10?9 mol/L時(shí)根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)的比例與對(duì)照無(wú)顯著差異，當(dāng)2，4-eBL濃度達(dá)到2×10?8～2×10?7 mol/L根不對(duì)稱生長(zhǎng)比例開始增大，且均與對(duì)照相比有極顯著差異。而本文也研究了濃度分別為0、2×10?13、2×10?12、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L的2，4-eBL對(duì)小白菜初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)濃度越高，小白菜初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)越明顯?？梢夿Rs不論是對(duì)單子葉植物還是雙子葉植物，都能夠誘導(dǎo)其根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)。

除BRs之外，乙烯（Ethylene， Eth）和茉莉酸（Jasmonic acid， JA）也能夠誘導(dǎo)植物根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)。Woods等[28]發(fā)現(xiàn)外源施加不同濃度的Eth可以誘導(dǎo)番茄幼苗根發(fā)生卷曲，卷曲程度取決于Eth濃度，并且添加銀離子能阻止此現(xiàn)象的發(fā)生。Cai等[24]發(fā)現(xiàn)2，4-eBL誘導(dǎo)水稻初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)的作用能被Eth抑制劑氨基氧乙酸（amino oxyacetic acid， AOA）、CoCl2和銀離子抑制，從而證明Eth可參與油菜素內(nèi)酯調(diào)控的水稻初生根不對(duì)稱生長(zhǎng)。Jiang等[27]報(bào)道自然生長(zhǎng)的野生型水稻初生根不會(huì)發(fā)生卷曲，當(dāng)外源施加0.1 μmol/L JA時(shí)，可誘導(dǎo)5%的初生根卷曲，0.5 μmol/L JA能誘導(dǎo)10%的水稻根發(fā)生卷曲。然而BRs在誘導(dǎo)雙子葉植物根發(fā)生不對(duì)稱生長(zhǎng)的過(guò)程與Eth和JA是否存在聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。

BRs還能影響初生根的向地性反應(yīng)以及根長(zhǎng)。Kim等[29]發(fā)現(xiàn)BRs在功能上與生長(zhǎng)素（Auxin， IAA）結(jié)合調(diào)控植物根部向重力性。不同濃度的BL對(duì)玉米根的向地性影響不同，BL濃度范圍在10?9～10?5 mol/L時(shí)，會(huì)增強(qiáng)根的向地性。在濃度為10?7 mol/L時(shí)向地性角度達(dá)到最大值[19]。而本文研究了濃度為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L 2，4-eBL對(duì)小白菜初生根向地性反應(yīng)的影響，結(jié)果表明在這些濃度下，BRs對(duì)向地性反應(yīng)有減弱作用。且2，4-eBL濃度為2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L時(shí)，小白菜初生根的向地性角度逐漸減小，而不對(duì)稱生長(zhǎng)的程度逐漸增大。根的向地性與不對(duì)稱生長(zhǎng)之間有何種聯(lián)系還不得而知。

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