2株高產(chǎn)蛋白微藻細(xì)胞代謝物的比較

李貴麗 魏曉奕 周偉 李積華 韓志萍

摘? 要? 以2株新近分離出來的鏈帶藻（Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74）為研究對象，檢測胞內(nèi)主要細(xì)胞代謝產(chǎn)物組成及含量變化，找出優(yōu)勢細(xì)胞代謝產(chǎn)物。收集相同時間間隔下培養(yǎng)的2株微藻，經(jīng)過凍干、研磨、復(fù)溶，制備成細(xì)胞溶解液，再進(jìn)行逐級萃取，分級檢測每個萃取步驟中所得細(xì)胞代謝產(chǎn)物的含量。結(jié)果表明：在BG11培養(yǎng)基中生長30 d，鏈帶藻Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74的最高蛋白含量分別達(dá)到細(xì)胞干重的71.68%和62.14%，其他代謝產(chǎn)物，如碳水化合物、脂質(zhì)和色素，在2株微藻中的含量都沒有超過20%。對比其他微藻的文獻(xiàn)報(bào)道，鏈帶藻Desmodesmus sp. QL96是目前發(fā)現(xiàn)的蛋白含量最高的藻株，其蛋白的表達(dá)模式和蛋白相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)具有研究價值。

關(guān)鍵詞? 鏈帶藻;代謝產(chǎn)物;蛋白;脂質(zhì)中圖分類號? Q949.2? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

Abstract? To reveal the dominant cell metabolites， as well as their contents， including carbohydrates， lipids， proteins， chlorophyll and carotenoid of two newly isolated microalgae （Desmodesmus sp. QL96 and Desmodesmus sp. QJ74）. Two microalgae were collected at the dedicated culture time， the cells were lyophilized， ground and resuspended to prepare a cell lysate， and then subjected to stepwise extraction and fractionation to detect the content of the cell metabolite obtained in each extraction step. The results showed that the protein content of Desmodesmus sp. QL96 and Desmodesmus sp. QJ74 reached up to 71.68% and 62.14% of the cell dry weight which were grown in the BG11 medium for 30 days， respectively. The contents of other cell metabolites were much lower， none exceeding 20% of the cell dry weight. Compared to other microalgae in literatures， Desmodesmus sp. QL96 is the most protein abundant microalgae and deserves further study， including protein expression patterns and protein-sourced product development.

Keywords? Desmodesmus sp.; metabolites; protein; lipid

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.024

微藻是單細(xì)胞微生物，和其他微生物一樣，只有利用顯微鏡才能分辨其形態(tài)特征[1]。微藻種類多樣，已經(jīng)分離鑒定的微藻種屬有螺旋藻、小球藻、杜氏藻、紅球藻等幾萬種[1-2]。微藻繁殖速度快、和植物一樣可以進(jìn)行光合作用，是自然界中光合效率最高、生長最為迅速的原始生物種類之一[3]。其細(xì)胞代謝產(chǎn)物包括多糖、蛋白質(zhì)、脂肪酸、色素等多種生物質(zhì)成分[3]，這些成分的開發(fā)利用研究近年來已逐漸成為熱點(diǎn)，例如以微藻脂質(zhì)為原料的生物柴油[4]、以微藻蛋白為主要原料[5]、微藻多糖為主要功效成分的保健品等產(chǎn)品[6-7]的開發(fā)研究。然而這些開發(fā)項(xiàng)目大多停留在初級階段，在產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用十分有限，其原因主要是經(jīng)濟(jì)成本較高，而經(jīng)濟(jì)成本和微藻代謝產(chǎn)物含量的高低直接相關(guān)。獲得高產(chǎn)生物成分微藻的途徑一般有兩個，一是篩選天然高產(chǎn)微藻，二是通過基因工程技術(shù)提高微藻細(xì)胞中部分生物成分的產(chǎn)量。一些通過基因技術(shù)建立的工程藻，在實(shí)驗(yàn)室生長狀態(tài)良好，在開放池塘卻顯示了諸多不適[8]，因而篩選天然高產(chǎn)微藻更加具有可行性。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)一些鏈帶藻具有較好的環(huán)境適應(yīng)性，如在新疆沙漠地區(qū)分離得到耐干旱的富油鏈帶藻Desmodesmus sp. XJ842[9]，臺灣高濕熱地區(qū)分離得到的高產(chǎn)油能力的鏈帶藻Desmodesmus sp. F2等，這些鏈帶藻對惡劣環(huán)境的適應(yīng)力近年來吸引了廣泛的關(guān)注。本文以新近從我國西藏高原和云貴高原地區(qū)分離出來的2株鏈帶藻為研究對象，以鹽水BG11為培養(yǎng)基，利用各種方法檢測了藻株細(xì)胞中的主要組分，以挖掘其潛在的開發(fā)前景和應(yīng)用領(lǐng)域。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.2? 方法

1.2.1? 微藻培養(yǎng)? 微藻培養(yǎng)基選用BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)基[10]。無菌操作條件下，在250 mL的三角瓶中裝入100 mL培養(yǎng)基，接入5×107個微藻細(xì)胞，在溫度（25±1） ℃、光照強(qiáng)度8000 lx、光暗周期12 h∶12 h的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 d。在設(shè)置的時間點(diǎn)上，將微藻通過抽濾的方法收集后再真空冷凍干燥[11]，獲得干藻粉，于?20 ℃儲存直至測定分析[12]。

1.2.2? 生物量的測定? 微藻接種后每隔3 d，從每個培養(yǎng)液中抽取10 μL，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)測定Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74的細(xì)胞數(shù)變化情況，剩余的培養(yǎng)液經(jīng)抽濾和凍干后測細(xì)胞干重，繪制2株鏈帶藻的生長曲線。

1.2.3? 主要細(xì)胞代謝產(chǎn)物的測定? 接種后每隔6 d收集一次微藻，凍干后于研缽中磨碎，復(fù)懸于25%的甲醇?xì)溲趸c溶液和pH 7.4的磷酸鹽緩沖液混合液（74∶1，V/V）[12-13]，制備細(xì)胞溶解液，用以測定其中的總糖、蛋白、脂質(zhì)、葉綠素和類胡蘿卜素的含量。

總糖含量測定：參照Chen等[12]的方法，取上述溶解液0.6 mL，加入1.2 mL經(jīng)過4 ℃預(yù)冷的75% H2SO4，渦旋混合2 min，繼續(xù)加入2.4 mL蒽酮試劑，于沸水浴下15 min后，迅速冷卻至室溫，于578 nm下測定吸光度。空白對照取0.6 mL溶解液加入3.6 mL經(jīng)過4 ℃預(yù)冷的75% H2SO4，不加蒽酮試劑測定吸光度。以D-葡萄糖為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總蛋白含量測定：蛋白含量以考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測定[14]。即取500 μL溶解液，于沸水浴25～30 min后，迅速冷卻至室溫，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染液，震蕩2 min，混勻后于595 nm下測定吸光度。以BSA為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

色素含量測定：按Chen等[12]的方法并進(jìn)行了適當(dāng)修改，即取溶解液8 mL于沸水浴25～30 min后迅速冷卻至室溫，與12 mL氯仿甲醇溶液（2∶1，V/V）混合，渦旋混合2 min，離心，取上層水相于416和453 nm測定吸光度，按照公式（1）和（2）分別計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的含量。取下層有機(jī)相于480和430 nm測定吸光度，根據(jù)公式（3）計(jì)算類胡蘿卜素含量。

脂質(zhì)含量的測定：參照Chen 等[12]的方法，取色素含量測定步驟中分離得到的有機(jī)相2 mL，加入1 mol/L三乙醇胺∶1 mol/L乙酸∶6.45%硝酸銅混合液（9∶1∶10，V/V/V）2 mL，渦旋混合2 min，于10000 r/min離心2 min，取下層有機(jī)相于260 nm下測定吸光度。對照樣本中加入1 mol/L三乙醇胺∶1 mol/L乙酸（9∶1，V/V）2 mL，不添加硝酸銅成分，以棕櫚酸為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

微藻培養(yǎng)的每個預(yù)設(shè)的時間點(diǎn)都設(shè)置3個獨(dú)立的平行培養(yǎng)，收集的每個樣品都進(jìn)行3次平行的分析檢測。采用 Excel 2007和 Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與圖形繪制。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 生長曲線的測定

細(xì)胞中蛋白含量隨時間變化呈一定的波動性（圖2B），總的來說在微藻細(xì)胞干重的40%～75%。Desmodesmus sp. QL96的蛋白含量隨培養(yǎng)時間的延長呈凹字形變化，在接種后第12～24天，蛋白含量處于平緩的低谷，第6和30天的蛋白含量較高，分別是0.717 mg/mg和0.678 mg/mg。Desmodesmus sp. QJ74的蛋白含量變化呈明顯的波浪形，在第6、18和30天時較高，而在第12天和第24天時較低，在0.463～ 0.621 mg/mg范圍內(nèi)變化。

2株藻細(xì)胞中脂質(zhì)含量變化趨勢如圖2C所示，Desmodesmus sp. QL96脂質(zhì)含量隨培養(yǎng)時間延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在培養(yǎng)12 d后Desmodesmus sp. QL96脂質(zhì)含量達(dá)到0.157 mg/mg，之后逐漸下降，而Desmodesmus sp. QJ74中脂質(zhì)含量始終呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，從第18天起，2株藻的脂質(zhì)含量均在0.10 mg/mg左右，在第30天時約為0.086 mg/mg。

Desmodesmus sp. QL96中葉綠素A和B的含量都隨培養(yǎng)時間的延長而增加（圖2D、圖2E），其中葉綠素A的含量在培養(yǎng)第6天時為0.010 mg/mg，每天長勢較均勻，在第30天時達(dá)到0.023 mg/mg，葉綠素B在0～18 d長勢較好，之后在達(dá)到0.004 mg/mg后水平保持穩(wěn)定。Desmodesmus sp. QJ74中葉綠素A的含量隨培養(yǎng)時間的延長從0.012 mg/mg降到了0.007 mg/mg（圖2D），葉綠素B的平均含量呈現(xiàn)先下降后緩慢上升的趨勢，最低為0.002 mg/mg （圖2E）。

類胡蘿卜素在Desmodesmus sp. QL96中隨時間呈現(xiàn)先增后降的趨勢（圖2F），在第18天達(dá)到最大，為0.004 mg/mg，而其在Desmodesmus sp. QJ74的細(xì)胞溶解液中沒有檢出。

2.3? 細(xì)胞主要代謝產(chǎn)物

對細(xì)胞主要代謝成分的檢測主要參照Chen等[12]的方法，通過制備細(xì)胞溶解液、逐級萃取、分級檢測的路徑，檢測了對數(shù)中期（第12天）中每個萃取步驟中所得產(chǎn)物的含量，繪制了細(xì)胞代謝產(chǎn)物總圖（圖3）。

從圖3中可見，鏈帶藻Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74在BG11培養(yǎng)基中25 ℃下生長的主要細(xì)胞代謝產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，其含量分別占2株藻細(xì)胞干重的56.65%和45.97%。其次是脂質(zhì)，其含量約占細(xì)胞干重的10.50%和11.20%，碳水化合物含量約占細(xì)胞干重的7.64%和7.70%。其他細(xì)胞代謝物，如葉綠素、類胡蘿卜素的含量均小于2.5%。

3? 討論

本文研究了新近分離出來的鏈帶藻Des

Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74的主要細(xì)胞代謝物都是蛋白質(zhì)，在生長的對數(shù)中期（第12天），其蛋白含量分別占細(xì)胞干重的56.65%和45.97%（圖3），然而Desmodesmus sp. QJ74的生物質(zhì)產(chǎn)率較低（圖1），因而總體來說，Desmodesmus sp. QL96的綜合蛋白產(chǎn)率更高。其最大蛋白產(chǎn)率0.717 mg/mg（圖3B），超過了現(xiàn)有報(bào)道中蛋白含量較高的小球藻C. vulgaris（0.6 mg/mg）[19]和極大螺旋藻Spirulina maxima（0.7 mg/mg）[20]。Desmodesmus sp. QL96中的蛋白含量隨培養(yǎng)時間呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢（圖2B），而生物質(zhì)產(chǎn)率/細(xì)胞數(shù)目則呈現(xiàn)先上升后平緩的趨勢（圖1），說明細(xì)胞增長的過程消耗了細(xì)胞內(nèi)部的蛋白，這可能是由于細(xì)胞自身合成的蛋白酶水解了部分蛋白，也可能是細(xì)胞代謝過程中消耗了部分蛋白[11]，其中的分子機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

脂類物質(zhì)是鏈帶藻Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74細(xì)胞中含量第二的成分（圖2），然而在2株藻的含量都少于20%（圖3C），再者是碳水化合物，而其他組分如葉綠素、類胡蘿卜素等的含量均很少。其碳水化合物的含量與同科的冬生柵藻接近[21]，但均低于小球藻[22]、鹽生杜氏藻[14]和其他的球綠微藻[14]。

4? 結(jié)論

新近分離出來的鏈帶藻Desmodesmus sp. QL96蛋白含量可達(dá)細(xì)胞干重的71.68%，是目前報(bào)道的所有微藻中蛋白含量最高的藻種。Desmo-

參考文獻(xiàn)

Rugnini L， Costa G， Congestri R， et al. Phosphorus and metal removal combined with lipid production by the green microalga Desmodesmus sp.： An integrated approach[J]. Plant Physiology & Biochemistry， 2018，125： 45.

Mata T M， Martins A A， Caetano N S. Microalgae for biodiesel production and other applications： A review[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews， 2010， 14（1）： 217-232.

鮑亦璐. 微藻培養(yǎng)過程的營養(yǎng)優(yōu)化與控制研究[D]. 廣州： 華南理工大學(xué)， 2012.

Katiyar R， Bharti R K， Gurjar B R， et al. Utilization of de-oiled algal biomass for enhancing vehicular quality biodiesel production from Chlorella sp. in mixotrophic cultivation systems[J]. Renewable Energy， 2018， 122： 80-88.

Garcia E S， Leeuwen J V， Safi C， et al. Selective and energy efficient extraction of functional proteins from microalgae for food applications[J]. Bioresource Technology， 2018， 268： 197-203.

陳宇婷. 兩種海洋微藻多糖抑制腫瘤血管生成活性的研究[D]. 大連： 大連海洋大學(xué)， 2017.

趙震宇， 劉平懷， 王盛林， 等. 微藻資源綜合開發(fā)與利用研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)， 2017， 38（11）： 275-278.

Courchesne N M D， Parisien A， Wang B， et al. Enhancement of lipid production using biochemical， genetic and transcription factor engineering approaches[J]. Journal of Biotechnology， 2009， 141（1）： 31-41.

王程惠， 何梅琳， 鄒山梅， 等. 響應(yīng)面優(yōu)化產(chǎn)油沙漠鏈帶藻（Desmodesmus sp. XJ842）的培養(yǎng)基組成[J]. 中國油脂， 2016， 41（1）： 45-50.

Ji F， Hao R， Liu Y， et al. Isolation of a novel microalgae strain Desmodesmus sp. and optimization of environmental factors for its biomass production[J]. Bioresource Technology， 2013， 148（8）： 249-254.

Chen Y， Vaidyanathan S. A simple， reproducible and sensitive spectrophotometric method to estimate microalgal lipids[J]. Analytica Chimica Acta， 2012， 724（8）： 67-72.

Chen Y， Vaidyanathan S. Simultaneous assay of pigments， carbohydrates， proteins and lipids in microalgae[J]. Analytica Chimica Acta， 2013， 776（9）： 31-40.

Converti A， Casazza A A， Ortiz E Y， et al. Effect of temperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content of Nannochloropsis oculata and Chlorella vulgaris for biodiesel production[J]. Chemical Engineering & Processing Process Intensification， 2009， 48（6）： 1146-1151.

蔣大程， 高? 珊， 高海倫， 等. 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量中的細(xì)節(jié)問題[J]. 實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)， 2018（3）： 119-122.

劉婷婷. 光氮培養(yǎng)模式對小球藻生長及脂質(zhì)積累的影響[D]. 湘潭： 湘潭大學(xué)， 2017.

艾江寧， 姚長洪， 孟迎迎， 等. 生長速度快且油脂產(chǎn)率高的湛江等鞭金藻誘變株的篩選[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2015， 42（1）： 142-147

Xie Y， Zhao X， Chen J， et al. Enhancing cell growth and lutein productivity of Desmodesmus sp. F51 by optimal utilization of inorganic carbon sources and ammonium salt[J]. Bioresource Technology， 2017， 244（1）： 664-671.

羅? 寧， 張? 森， 劉平懷. 氮、磷對熱帶海洋富油微藻Desmodesmus sp.WC08生長及油脂積累的影響[J]. 食品工業(yè)科技， 2016， 37（4）： 223-227.

Sankaran R， Manickam S， Yap Y J， et al. Extraction of Proteins from Microalgae using Integrated Method of Sugaring-out Assisted Liquid Biphasic Flotation （LBF） and Ultrasound[J]. Ultrasonics Sonochemistry， 2018： 48.

Shimamatsu H. Mass production of Spirulina， an edible microalga[J]. Hydrobiologia， 2004， 512（1-3）： 39-44.

Zhao G， Xue C， Lei W， et al. Ultrasound assisted extraction of carbohydrates from microalgae as feedstock for yeast fermentation[J]. Bioresource Technology， 2013， 128（1）： 337- 344.

Lin Q， Lin J. Effects of nitrogen source and concentration on biomass and oil production of a Scenedesmus rubescens like microalga[J]. Bioresource Technology， 2011， 102（2）： 1615-1621.

Ho S H， Chen C N N， Lai Y Y， et al. Exploring the high lipid production potential of a thermotolerant microalga using statistical optimization and semi-continuous cultivation[J]. Bioresource Technology， 2014， 163（7）： 128-135.

Shihhsin H， Lai Y Y， Chunyu C， et al. Selection of elite microalgae for biodiesel production in tropical conditions using a standardized platform[J]. Bioresource Technology， 2013， 147（4）： 135.

Gissibl A， Care A， Parker L M， et al. Microwave pretreatment of paramylon enhances the enzymatic production of soluble β-1，3-glucans with immunostimulatory activity[J]. Carbohydrate Polymers， 2018， 196： 339.