Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化桃紅四物丸的醇提工藝

汪盈盈,馮學(xué)花,馬然然

(1.安徽中醫(yī)藥科學(xué)院亳州中醫(yī)藥研究所,安徽 亳州 236800;2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,安徽 亳州 236800;3.安徽新華學(xué)院,安徽 合肥 230031)

桃紅四物湯是古代活血化瘀的經(jīng)典名方,最早在《醫(yī)宗金鑒》記載[1](P413),[2]。本方藥由桃仁、紅花、熟地、當(dāng)歸、芍藥、川芎組成,主養(yǎng)血、活血、調(diào)經(jīng)止痛,用于血虛有淤之證,臨床應(yīng)用多見(jiàn)于婦科。現(xiàn)代臨床研究表明,桃紅四物湯不僅用于治療婦科疾病,此方中的有效成分沒(méi)食子酸具有抗炎、抗菌,抗病毒等作用,另外還能抗腫瘤,抑制肥大細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移;羥基紅花黃素A是紅花里最高效的水溶性成分,它具有抑制血小板凝聚,抗心肌缺血,抗炎,抗腫瘤活性等藥理活性;阿魏酸對(duì)血小板凝聚、血小板解聚、抗血栓形成有一定的抑制作用[3-7]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

U3000 HPLC (賽默飛世爾科技有限公司)、RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生物技術(shù)有限公司)、HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)、ZXFD-B5040恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海智城儀器制造有限公司)、SHZ-D (III)循環(huán)水多用真空泵(鞏義市英峪高科儀器廠)、SQP(1/10萬(wàn))分析天平(賽多利斯科技(北京)有限公司)、電子秤(上海友聲衡器有限公司)、KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)、800 Y多功能粉碎機(jī)(永康市鉑歐五金制品有限公司)。

1.2 藥材

實(shí)驗(yàn)所用中藥材均從安徽新興中藥材飲片有限公司購(gòu)入,經(jīng)亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院陳娜副教授鑒定地黃為玄參科植物地黃的干燥塊根(批號(hào):21082202)。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸的根及根莖(批號(hào):21101501)。川芎為傘形科植物川芎的干燥根(批號(hào):21071502)。芍藥為毛茛科植物白芍的干燥根(批號(hào):21102702)。桃仁為薔薇科植物桃或山桃的干燥成熟種仁(批號(hào):21092501)。紅花為菊科紅花屬植物紅花的干燥管狀花(批號(hào):21112002)[8]。

1.3 試劑

無(wú)水乙醇(分析純,天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司)、甲醇(色譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠)、乙腈(色譜純,天津一方科技有限公司)、磷酸、超純水。

1.4 對(duì)照品

沒(méi)食子酸(批號(hào):110831-201906,含量:91.5%)、羥基紅花黃色素A(批號(hào):111637-201207,含量:92.5%)、阿魏酸(批號(hào):110773-201915,含量:99.4%)。均來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

2 方法

2.1 桃紅四物湯中有效成分的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱(4.6×250毫米,5微米);流動(dòng)相使用乙腈(A通道)和0.05%磷酸水溶液(B通道);采用梯度洗脫,梯度洗脫系統(tǒng)如表1;流速設(shè)置為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):保留時(shí)間0～11分鐘時(shí)為290 nm,11～27分鐘為320 nm,27～45分鐘為230 nm,45～80分鐘為290 nm;柱溫設(shè)置為40 ℃;進(jìn)樣量:混合對(duì)照品20 μl,供試品20 μl[9]。

表1 梯度洗脫系統(tǒng)

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取川芎6克、紅花6克、桃仁9克、當(dāng)歸9克,置圓底燒瓶中,加6倍量50%乙醇,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加熱回流提取(1次)2小時(shí)后,過(guò)濾,得提取藥液。精密量取5 mL提取液放入已恒重蒸發(fā)皿中,水浴蒸干得流浸膏,置烘箱中得干膏,取適量,用50%甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,50%甲醇定容,搖勻,超聲,過(guò)濾后為樣品溶液。

2.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取適量的阿魏酸、羥基紅花黃色素 A、沒(méi)食子酸對(duì)照品粉末分別置10 mL容量瓶中,50%甲醇溶解定容至刻度,制備成對(duì)照品溶液。將上述幾種對(duì)照品溶液分別精密量取,按比例混合、濾過(guò),即得混合對(duì)照品溶液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

A圖:混合對(duì)照品溶液HPLC圖譜 B圖:混合樣品溶液HPLC圖譜圖1 HPLC色譜圖

精密量取混合對(duì)照品溶液0.5 mL,1.0 mL,2.0 mL,3.0 mL,4.0 mL,5.0 mL,分別置10 mL容量瓶中,50%的甲醇定容,搖勻,過(guò)濾,按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,以溶液的濃度為X軸,有效成分的峰面積為Y軸,建立回歸方程,沒(méi)食子酸的回歸方程為:Y=0.1439X+0.9003(r=0.9997),羥基紅花黃色素A的回歸方程為:Y=0.122478X+0.0255(r=0.9998),阿魏酸的回歸方程為:Y=0.2149X+0.0589(r=0.9999)。沒(méi)食子酸在0.0245～0.245 mg/ mL、羥基紅花黃色素A在0.022～0.22 mg/ mL、阿魏酸在0.0245～0.245 mg/ mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好[10-11]。

(3)經(jīng)過(guò)一系列加固整治措施后，湖區(qū)內(nèi)圩堤的防洪能力有了較大提高,但仍然存在城市防洪標(biāo)準(zhǔn)低、新出險(xiǎn)工險(xiǎn)段、堤容堤貌差、部分項(xiàng)目未按設(shè)計(jì)完成、工程管理和監(jiān)測(cè)設(shè)施不完善、防汛交通條件差、圩區(qū)排澇能力不足等問(wèn)題。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

精密量取混合對(duì)照品溶液,依照2.1.1色譜條件連續(xù)平行進(jìn)樣。測(cè)得沒(méi)食子酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸的峰面積,三種成分的RSD(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)值分別為0.83%、0.94%、0.67%,結(jié)果表明三個(gè)成分峰面積的RSD值均小于2.0%,說(shuō)明該儀器的精密度較好。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取混合供試品溶液,按2.1.1色譜條件,室溫條件下在0、2、4、8、12、24小時(shí)的分別進(jìn)樣,測(cè)定沒(méi)食子酸,羥基紅花黃色素A,阿魏酸的峰面積,RSD值分別為0.65%,0.93%,0.53%,對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,三者RSD值相差不大且在2%以下,表明該樣品在24小時(shí)內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取混合供試品溶液,按2.1.1色譜條件進(jìn)行樣品測(cè)定。得到?jīng)]食子酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸的峰面積,其RSD值分別為1.06%,1.10%,0.66%,結(jié)果表明本方法有較好的準(zhǔn)確性。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)

2.1.8 加樣回收率考察

取適量沒(méi)食子酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸對(duì)照品分別加入已知含量的6份樣品溶液中,再按照2.1.1色譜條件進(jìn)樣,計(jì)算平均回收率及其RSD,結(jié)果表明:沒(méi)食子酸平均回收率為98.69%,RSD=1.19%;羥基紅花黃色素A平均回收率為99.15%,RSD=1.32%;阿魏酸平均回收率為98.01%,RSD=1.53%,說(shuō)明本品的加樣回收率符合要求。注:樣品的加樣回收率=(加對(duì)照品后測(cè)得含量-已知樣品的含量)/加入對(duì)照品的量×100%。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 加樣回收率考察

2.2 醇提工藝單因素試驗(yàn)

在其他工藝參數(shù)不變的條件下,分別討論不同液料比(4、6、8和10倍)、提取時(shí)間(1、1.5、2和2.5h)、提取溶劑的濃度(30、50、70和90%)對(duì)桃紅四物湯綜合評(píng)分的影響,見(jiàn)表6單因素變化條件,為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的選擇提供依據(jù)。注:綜合評(píng)分=(有效成分總含量/最大總含量)×70%+(干膏得率/最大干膏得率)×30%。

表6 單因素變化條件

干膏得率的計(jì)算:記處方的藥材重量為ms,經(jīng)過(guò)恒重的蒸發(fā)皿重量為m1,干燥后的浸出物和蒸發(fā)皿重量之和為m2,精密加入的乙醇量為V1,精密量取的上清液體積為V2,按照公式醇溶性浸出物(%)=(m2-m1)/ms ×V2/V1 ×100%,計(jì)算可得。

2.2.1 液料比對(duì)綜合評(píng)分的影響

根據(jù)表6的單因素變化情況進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以綜合評(píng)分為依據(jù),桃紅四物湯提取液的綜合評(píng)分隨著液料比的不同呈不規(guī)則曲線變化,見(jiàn)圖2單因素試驗(yàn)結(jié)果,在液料比為6倍時(shí),綜合評(píng)分達(dá)到最高,8倍時(shí)較高,雖然4倍和10倍時(shí)綜合評(píng)分相近,但考慮到液料比過(guò)大會(huì)給后續(xù)的提取液蒸發(fā)增加難度,故確定因素水平為4、6和8倍。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響

根據(jù)表6的單因素變化情況進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以綜合評(píng)分為依據(jù),見(jiàn)圖2單因素試驗(yàn)結(jié)果,可知提取時(shí)間為1.5 h、2 h和2.5 h時(shí)綜合評(píng)分較高,且在2 h時(shí)達(dá)到最高,故確定因素水平為1.5 h、2 h和2.5 h。

2.2.3 提取溶劑(乙醇)的濃度對(duì)綜合評(píng)分的影響

根據(jù)表6的單因素變化情況進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以綜合評(píng)分為依據(jù),見(jiàn)圖2單因素試驗(yàn)結(jié)果,可知乙醇濃度為30%、50%和70%時(shí)綜合評(píng)分最高,且在50%時(shí)達(dá)到最高啊,故確定因素水平為30%、50%和70%。

2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化醇提工藝

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn),得到了各因素的水平值,并將液料比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溶劑濃度(C)作為自變量,1次作為總提取次數(shù),以三種有效成分的含量和干膏得率的綜合評(píng)分(R)為響應(yīng)值,采用 Design Expert軟件12.0版本進(jìn)行3因素3水平17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的Box-Behnken設(shè)計(jì),得到響應(yīng)面分析模型,對(duì)其醇提工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳的工藝條件。因素與水平見(jiàn)表7,醇提工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表8。

表7 實(shí)驗(yàn)因素和水平

表8 提取工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.2 數(shù)據(jù)擬合及方差分析

通過(guò) Design Expert12.0軟件對(duì)表8的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,以三因素綜合評(píng)分進(jìn)行響應(yīng)面分析,對(duì)各個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析,得出多元二次回歸方程:Y=97.56-2.49A+1.01B-1.78C+0.0925AB+0.5875AC+4.00BC-6.32A2-4.61B2-5.01C2。方差分析結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 方差分析結(jié)果

根據(jù)表9可以看出,該回歸模型P<0.0001,顯示了該模型的極顯著性(P<0.01極其顯著,P<0.05顯著),失擬項(xiàng)P=0.2477>0.05,無(wú)顯著性,說(shuō)明該模型的擬合度和可信度都很高,且試驗(yàn)誤差也比較小。R2=0.9799,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值較吻合,該模型可以應(yīng)用于乙醇提取工藝的綜合評(píng)分預(yù)測(cè),為優(yōu)化乙醇提取工藝提工依據(jù)。從表9的顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn):單因素A、C均顯著性(P<0.05),交互因素BC極其顯著(P=0.0004<0.05),且二次項(xiàng)的A2、B2、C2均有顯著性(P<0.01)。三個(gè)因素對(duì)桃紅四物湯醇提工藝的影響依次為:液料比>乙醇濃度>提取時(shí)間,交互因素對(duì)綜合評(píng)分的影響大小順序?yàn)?BC>AC>AB。

2.3.3 響應(yīng)面圖譜分析

根據(jù)交互因素對(duì)綜合評(píng)分的影響,通過(guò)響應(yīng)面分析軟件得到響應(yīng)面3D曲線圖譜和等高線圖,從響應(yīng)面圖譜上可以更直觀地看到各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響程度及變化趨勢(shì)。曲面傾斜的程度反映了交互因素對(duì)綜合評(píng)分影響的大小,等高線的密度則反映了單因素對(duì)綜合評(píng)分的影響。由圖3響應(yīng)面圖譜可以看出,提取時(shí)間和乙醇濃度兩因素的交互作用曲面是最陡峭的,且等高線呈近橢圓形,說(shuō)明對(duì)綜合評(píng)分的影響最大;而液料比和乙醇濃度對(duì)綜合評(píng)分的交互影響不大,其等高線圖近似于圓形;液料比和提取時(shí)間的交互影響最小,其等高線圖與圓周曲線相近。然后,各個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的交互作用有顯著的排序: BC>AC>AB,與表9的方差分析結(jié)果一致。再根據(jù)軟件計(jì)算、綜合評(píng)分、操作方便確定最優(yōu)方案[5]。

圖3 響應(yīng)面圖譜

通過(guò)使用響應(yīng)面軟件預(yù)測(cè)得到桃紅四物丸的最優(yōu)醇提工藝為:液料比5.59倍,提取時(shí)間2.01小時(shí),乙醇濃度46.4%,預(yù)測(cè)的綜合評(píng)分為97.99%?？紤]到生產(chǎn)過(guò)程中的實(shí)施可行性,需要將預(yù)測(cè)的最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為:液料比6倍,提取時(shí)間2小時(shí),乙醇濃度50%。

3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

分別按處方稱取三份藥材,在上述條件下進(jìn)行三次平行試驗(yàn),驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表10。所測(cè)得的綜合評(píng)分平均值為98.01%,RSD=0.66%,且三次平行試驗(yàn)的綜合評(píng)分都接近于響應(yīng)面法的預(yù)測(cè)值,由此證明調(diào)整后的醇提工藝是穩(wěn)定的、可行的,可作為桃紅四物湯的最優(yōu)醇提工藝。

表10 驗(yàn)證結(jié)果

4 討論

本文采用含量相對(duì)較高、分離度較好的川芎中的沒(méi)食子酸、川芎和當(dāng)歸中阿魏酸、紅花中羥基紅花黃素 A的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo), HPLC中沒(méi)食子酸的測(cè)定波長(zhǎng)為271 nm,保持時(shí)間約7分鐘,而對(duì)羥基紅花黃素 A的測(cè)定波長(zhǎng)為320 nm、約28 min、阿魏酸為230 nm、約41分鐘[9]。試驗(yàn)選用0.05%的乙腈-0.05%的磷酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,可以延長(zhǎng)色譜峰的保留時(shí)間,提高分離度,穩(wěn)定基線,檢測(cè)出更加適合的峰高[12]。為了避免在配制溶液中使用的50%甲醇影響后續(xù)測(cè)定的出峰和保留時(shí)間,采用空白對(duì)照品進(jìn)樣。

實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化,求得實(shí)驗(yàn)中最佳的工藝參數(shù)。傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)方法精度低、應(yīng)用范圍小,而響應(yīng)面法則可以通過(guò)建立回歸方程、響應(yīng)曲面模型、繪制等高線來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)各個(gè)因素水平的響應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)快速、方便地得到各因素水平的響應(yīng)值,并且可以將最佳工藝參數(shù)確定時(shí)的隨機(jī)誤差考慮在內(nèi)。這種方法具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、可以對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行連續(xù)分析的優(yōu)點(diǎn),而且所獲得的二次多項(xiàng)回歸方程可以簡(jiǎn)化后續(xù)的計(jì)算[13-15]。

本研究中確定了桃紅四物丸的最優(yōu)提取工藝為加6倍量50%乙醇,提取2小時(shí),提取液中沒(méi)食子酸、阿魏酸、紅花中羥基紅花黃素 A的含量較高,且實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值相符,表明Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選得到的提取工藝可靠,具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,可為桃紅四物丸的后續(xù)研究提供參考。