銅污染土壤中耐銅微生物的篩選與分離

劉婷婷 滕金浩

摘要[目的] 探索受銅污染土壤的微生物修復(fù)方法。[方法]運用單因素分析方法對受銅濃度脅迫的微生物進行篩選分離以及馴化。[結(jié)果]分離得到4種不同菌株，其中MD1菌株的銅耐受極限為4 000? mg/L，MD2菌株的銅耐受極限為6 000? mg/L，N1菌株的銅耐受極限為1 000 mg/L，ML菌株的銅耐受極限為8 000? mg/L。經(jīng)TAS-990F火焰原子分光光度計檢測后其對銅離子吸附能力依次為10.420、16.884、9.764、23.309? mg/g。[結(jié)論]ML菌株能較好地生成菌膠團，可作為耐銅微生物工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良菌種。

關(guān)鍵詞耐銅微生物;土壤修復(fù);重金屬污染;篩選

中圖分類號S154.3文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）02-0060-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.018

重金屬污染土壤中的的銅多以硫化物、硫酸鹽的形式存在，并具有隱蔽性、長期性和滯后性的特性[1]。其主要污染來源為污水灌溉、化工生產(chǎn)、礦石開采及冶煉等[2]。植物可通過根吸收土壤中的銅，在各部分累積分布，且多數(shù)為根>莖、葉>果實。但少數(shù)植物體內(nèi)銅的分布與此相反，如叢樺葉則為果>枝>葉[3]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在銅污染土壤生長的植物，含銅量為正常植物的33～50倍[4]。被植物吸附的銅可經(jīng)過食物鏈進入人體，當人體器官中富集、殘存了大量銅之后，容易對臟器產(chǎn)生負擔(dān)，特別是對肝臟和膽囊傷害，易于產(chǎn)生溶血性黃疸、腎功能衰竭等癥狀[5]。因此，我國于2008年修訂的《土壤質(zhì)量環(huán)境標準（GB 15618—2008）》規(guī)定了土壤中銅含量不超過50 mg/kg[6]。目前銅污染土壤修復(fù)技術(shù)主要為化學(xué)試劑改良等化學(xué)方法，這些技術(shù)成本較高且易引起二次污染，故利用微生物技術(shù)治理銅污染土壤已成為研究的前沿和熱點[7]。

研究表明，微生物對銅的富集表現(xiàn)在其胞外絡(luò)合、胞外吸附沉淀。如類脫硫弧菌可以與重金屬產(chǎn)生難溶性的硫化物就，并通過自身代謝將硫化物排除細胞外[8]。部分微生物對銅產(chǎn)生耐性的原因是通過細胞內(nèi)的植物螯合肽和金屬結(jié)合蛋白與重金屬配位結(jié)合[9]。微生物的銅耐性也表現(xiàn)在通過與其發(fā)生氧化還原反應(yīng)，改變重金屬的價態(tài)，降低其毒性，如部分微生物會分泌一些氧化還原酶，催化重金屬的氧化還原[10]。

利用微生物治理銅污染土壤的關(guān)鍵在于獲得較高耐受性的菌株，因此目前發(fā)現(xiàn)的耐銅微生物主要為細菌、真菌和藻類。其種類繁多，吸附能力也有差異，近年來發(fā)現(xiàn)的微生物主要有黑色巨藻（Laminaria nigresense）、大杯蕈（Clitocybe maxima）、銅綠假單孢菌（Pseudomon asaeruginosa）、花斑曲霉（Aspergillus versicolor）等[11-14]。這些研究大部分集中在國外，而國內(nèi)針對銅耐性菌株的研究較少。

筆者以浙江省嘉興市嘉善地區(qū)某工廠富含銅的表層土壤作為試驗用土，篩選分離得到銅的耐性菌株，并對其銅耐性機制進行分析，以闡明菌株耐受銅的機制，旨在為耐銅基因和能力的精確定位提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤。供試土壤來自于嘉興市嘉善地區(qū)典型工廠附近下風(fēng)向表層土壤（0～10 cm）。采樣點分布見圖1。分別采集嘉興市東南風(fēng)下風(fēng)向工廠周邊9個采樣點的土壤，采集后用保鮮袋密封并置于4 ℃冰箱保存。分析各土壤中重金屬含量，結(jié)果2-7中土壤銅含量最高，為57 mg/kg，故該試驗使用該采集點所采的土壤。

1.1.2培養(yǎng)基。

適合霉菌等真菌生長的培養(yǎng)基為馬丁氏培養(yǎng)基，其固體培養(yǎng)基配方：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g瓊脂15～20 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，1/3 000孟加拉紅水溶液100 mL，水800 mL，pH自然。

適合細菌生長的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其固體培養(yǎng)基配方：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～25 g，水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

分離出的另一種放線菌使用的為馬鈴薯蛋白胨培養(yǎng)基，其制法：將含有高淀粉的馬鈴薯300 g洗凈、去皮、切片后于水浴鍋中煮沸，邊煮邊攪拌，將其過濾取濾液，每1 000 mL培養(yǎng)基加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g。液體培養(yǎng)基取其濾液每1 000 mL培養(yǎng)基加入葡萄糖20 g。各液體培養(yǎng)基配方與上述除不加瓊脂外無差異。所有培養(yǎng)基均置于高溫高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3主要儀器。

超凈工作臺、光學(xué)顯微鏡、培養(yǎng)皿、試管、涂布棒、接種環(huán)、滅菌鍋、火焰原子分光光度計TAS-990F、銅空心陰極燈等。

1.2方法

1.2.1耐銅微生物的液體初篩。

將稀釋度分別為10-1、10-2、10-3、10-4的土壤懸液置于含系列濃度梯度的重金屬銅液體培養(yǎng)基（0、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000? mg/L）中，并置于37 ℃恒溫搖床下培養(yǎng)，初步篩選出具有銅耐受性的微生物。

1.2.2耐銅微生物的分離與純化。

利用平板涂布法進行微生物的分離，用膠頭滴管吸取10 mL已長出生物膜的菌液，分別用無菌水稀釋10、100、1 000倍，采用平板涂布進行菌株分離。

將分離菌株的培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)數(shù)日，菌株生長情況較好后進行平板劃線，以純化菌株，為保證菌株的單一劃線進行3次。

1.2.3耐銅微生物的鑒定。結(jié)合微生物形態(tài)分析鑒定和顯微鏡鏡檢對已分離純化的菌株進行初步鑒定。

1.2.4搖床不同轉(zhuǎn)速菌株生長情況。

于三角瓶中分別制備相應(yīng)培養(yǎng)基90 mL，并加入配制好的10 mL菌液，置于37 ℃恒溫搖床（轉(zhuǎn)速0、30、60、90、120、150 r/min）中培養(yǎng)，并實時觀察其微生物生長情況，待進入穩(wěn)定期測定培養(yǎng)瓶中菌膠團平均半徑，重復(fù)3次。

1.2.5生長曲線的測定。

將耐受微生物接種至不同銅濃度（0、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 mg/L）的相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床以37 ℃、120 r/min的條件下培養(yǎng)。每隔24 h取樣，于分光光度計測定OD600，以O(shè)D600為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制不同銅濃度下耐銅菌株的生長曲線。

1.2.6吸附能力的測定。

將耐受微生物接種至相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床37 ℃、120 r/min的條件下培養(yǎng)。待耐受微生物進入快速生長的對數(shù)生長期時，吸取上清液50 mL于50 mL離心管中，每種菌做2組，一組直接置于離心機內(nèi)以8 000 r/min離心5 min，通過過濾將沉于試管底部的微生物和重金屬收集至已稱重的濾紙上，置于105 ℃烘箱內(nèi)烘2 h，烘干后稱重。

另一組在在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，先配制王水（濃鹽酸與濃硝酸體積比為3∶1配制成），將所得下沉物質(zhì)轉(zhuǎn)移至坩堝內(nèi)置于300 ℃恒溫鐵板儀用王水消解，經(jīng)過消解的那組樣品用無菌水進行溶解，并用無菌水定容至50 mL，保存后采用火焰原子分光光度測定，計算菌株的吸附能力，重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)分析試驗數(shù)據(jù)用均值±標準差（mean±SD）表示;采用Excel 2016對試驗數(shù)據(jù)進行制圖;采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1液體初篩

經(jīng)過7 d的培養(yǎng)，分別發(fā)現(xiàn)在含10-2的土壤懸液、2 000 mg/L的馬丁氏液體培養(yǎng)基，含10-2的土壤懸液、1 000 mg/L牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，含10-2的土壤懸液、3 000 mg/L的馬鈴薯蛋白胨培養(yǎng)基中有較好的生物膜形成，且長勢較好。

2.2分離純化

于馬丁氏培養(yǎng)基中分離得到2種形態(tài)不同的菌株，分別命名為MD1、MD2，并通過平板劃線法得到單一菌株;于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中分離得到1種菌株，命名為N1;于馬鈴薯蛋白胨培養(yǎng)基中分離得到1種菌株，命名為ML菌株，同樣經(jīng)平板劃線得到單一菌株，待后續(xù)的鑒定、馴化以及特性研究。

2.3菌株初步鑒定

MD1菌株初步鑒定為黑曲霉（圖2），其形態(tài)大致分雙層，干燥，上層為孢子絲，其上已經(jīng)長出孢子，呈黑色球狀，下層基內(nèi)菌絲較黏稠但顏色較淺。MD2菌株初步鑒定為霉菌，為粉白色，干燥，上層孢子為粉色，下層基內(nèi)菌絲為白色。

N1菌株初步鑒定為革蘭氏陰性短桿菌，整體呈灰白色絮狀，難挑取，顯微觀察呈半透明短桿狀。

ML菌株初步鑒定為放線菌，乳白色，較難挑取，絨毛狀菌絲密集且細長。在顯微鏡下觀察ML菌株（圖3），發(fā)現(xiàn)菌絲形態(tài)是由垂直生長到彎曲生長并逐步向叢生發(fā)展，并存在游動的孢子[15]。

2.4菌株生長特性

對恒溫搖床中的ML菌株進行實時觀察發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)速為0 r/min的37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)下，培養(yǎng)液內(nèi)部基本無菌膠團的形成，4 d左右在液面處長出生物膜，對比其他轉(zhuǎn)速下微生物的生長發(fā)現(xiàn)，其他轉(zhuǎn)速情況液面下均有不同程度的菌膠團產(chǎn)生，可能為分離出的菌株均為好氧菌株導(dǎo)致。

由表1可知，當ML菌株培養(yǎng)轉(zhuǎn)速達120 r/min后，其生長情況和菌膠團成球能力較好，同時對比轉(zhuǎn)速150 r/min時，菌膠團成球情況并未明顯增加，故該試驗所分離出的菌株最適培養(yǎng)條件為37 ℃、120 r/min。

2.5菌株生長曲線

通過對OD600連續(xù)8 d的測量，繪制各菌株生長曲線，結(jié)果見圖4。由圖4可知，不同菌株在銅脅迫條件下生長趨勢不同，同時也受銅離子濃度的影響。恒溫搖床37 ℃、120 r/mn培養(yǎng)下MD1菌株的銅耐受極限為4 000 mg/L，

其生長潛伏期較長，在較低銅濃度下4d后進入對數(shù)生長期后快速到達峰值，表明此刻MD1菌株生長速率和濃度達到最高峰，培養(yǎng)液中MD1菌株的生物量也達到最大。在含7 000 mg/L馬丁氏液體培養(yǎng)基的生長曲線OD600一直在0.2附近，同時觀察培養(yǎng)基內(nèi)菌株生長情況，其內(nèi)基本未見生物膜或菌膠團，8 000 mg/L菌株代謝生長基本無法進行。

恒溫搖床37 ℃、120 r/mn培養(yǎng)下MD2菌株的銅耐受極限為6 000 mg/L，其生長停滯期較短，培養(yǎng)1 d后即迅速進入對數(shù)生長期，MD2菌株對數(shù)增長。在6 d左右培養(yǎng)液的OD600達到最高值，表明菌株生長速率和濃度達到最高峰，7 d后MD2菌株開始進入衰亡期，OD600開始下降。

在恒溫搖床37 ℃、120 r/mn培養(yǎng)下N1菌株的銅耐受極限為1 000 mg/L，觀察發(fā)現(xiàn)整體的N1生長曲線趨勢相似，迅速進入對數(shù)期但受銅的毒害影響較大，其OD600一直在0.2左右。結(jié)合液體初篩和固體平板培養(yǎng)綜合分析，N1菌株的耐性高，對銅的耐性約在1 000 mg/L。

恒溫搖床37 ℃、120 r/mn培養(yǎng)下ML菌株的銅耐受極限為8 000 mg/L， ML菌株在銅濃度8 000 mg/L后，其菌株的生長趨勢仍較好，通過比較各個不同銅濃度的ML菌株生長曲線發(fā)現(xiàn)，ML菌株仍受高濃度銅離子影響而生長較為緩慢。初期ML株停滯期較短，很快進入生長期，在生長初期由于ML菌株的耐受性較強，故各個濃度銅離子馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的OD600值相差不大，在3 d左右，在較低濃度的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中出現(xiàn)菌落的積聚，富集了培養(yǎng)液中的菌種，故OD600稍回落。由圖4可知，ML菌株整個生長周期約8 d。鑒于試驗時間局限性對ML菌株的馴化未能進行，ML菌株的耐銅極限為8 000 mg/L，且長勢較好，能夠較好地生成吸附銅離子的菌膠團。其耐受濃度與柴新義等[16]的1株銅綠微生物Cladosporium sp.的耐受性能相當，且同樣具有形成較好菌膠團的能力。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2019年

2.6吸附能力

為了更好地了解菌株對銅的吸附能力，取最大銅耐受極限濃度下對數(shù)生長期的上清液50 mL，分別經(jīng)離心、消解、定容制成待測樣品，并于火焰原子分光光度計TAS-990F進行吸附能力檢測。由表2可知，50 mL樣品中各菌

株對重金屬銅的吸附量均在20 mg左右，結(jié)合50 mL中樣品

菌干重分析，MD2菌株、 ML菌株的菌干重較小，其單位生物量的吸附能力則較強，并通過計算得圖5。由圖5可知，MD1菌株吸附能力為10.420 mg/g，MD2菌株吸附能力為16.884 mg/g，N1菌株吸附能力為9.764 mg/g，ML菌株吸附能力為23.309 mg/g。結(jié)合各菌株的耐受極限分析，N1菌株的耐受極限和吸附能力綜合表現(xiàn)最弱，但N1菌落初步鑒定為細菌，

可作為耐銅細菌吸附能力研究的試驗菌種。ML菌株的耐受極限為8 000 mg/L，其吸附能力為23.309 mg/g，是該試驗中分離出的4種菌株中最強的，且其菌落形成菌膠團的能力強、時間快。對比MD1菌株和MD2菌株發(fā)現(xiàn)，這2種菌株均為馬丁氏培養(yǎng)基中分離出的霉菌，但MD2菌株的耐受極限及吸附能力較MD1菌株高。

楊帥等[17]于安徽某銅礦區(qū)發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陽氏菌株的耐受極限為200 mg/L，相較該試驗于浙江嘉興地區(qū)所分離出的菌株，其耐受極限較低。分析其原因，浙江嘉興地區(qū)為酸性土壤，同時土壤采集地為金屬加工工廠附近，污染較為嚴重，已經(jīng)對本土菌株進行了一定的馴化。

同時對比同為浙江地區(qū)董新姣等[18]2003年發(fā)現(xiàn)的銅綠假單胞菌的耐受性，其耐受極限為560 mg/L，發(fā)現(xiàn)隨著我國工業(yè)化進程的不斷推進，土壤中重金屬含量的積累，微生物受馴化其耐受性也隨之增加，吸附能力也相應(yīng)增加。

3結(jié)論與討論

（1）微生物修復(fù)為重金屬污染修復(fù)土壤提供了較傳統(tǒng)物理、化學(xué)法更為高效、綠色的方法，其修復(fù)潛力巨大[19]。該研究從典型重金屬土壤中成功分離出4種不同耐銅菌株，初步鑒定菌株類型并測定其其生長曲線及吸附能力，確定菌株的生長特性、條件及對銅的吸附能力，初步鑒定菌株MD1、MD2、N1、ML分別為黑曲霉、霉菌、桿狀菌、放線菌。探索了耐性微生物的篩選、分離的機理，擴充了耐性微生物的種類，對菌株運用于含銅土壤的修復(fù)提供依據(jù)。

（2）現(xiàn)階段雖已有耐銅微生物的報道，但其耐受性不強：Pseudomonadaceae USTB-E 560 mg/L[20]、Aspergillus fumigatus 940 mg/L[21]、Rhizopus 1 920 mg/L[22]。該研究從典型重金屬土壤中成功分離出4種不同的耐銅菌株MD1、MD2、N1、ML銅耐受極限分別為4 000、6 000、1 000、8 000 mg/L;吸附強度分別為10.420、16.884、9.764、23.309 mg/g，為已發(fā)現(xiàn)耐銅微生物中較優(yōu)質(zhì)的菌株。

（3）ML菌株的耐受極限達8 000 mg/L，吸附性能為23.309 mg/g，與已報道的銅綠微生物Cladosporium sp[16]相似，且ML菌株的吸附性能更強，其在搖床37 ℃、120 r/min下形成的菌膠團半徑更大，其長勢較好，易于后續(xù)土壤修復(fù)的工業(yè)化生產(chǎn)。

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