花椰菜松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

史滟滪　劉艷軍　楊靜慧　牟坤

摘 ? ?要：本研究采用花椰菜組培苗不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織，從中篩選出理想外植體類(lèi)型;將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)移到不同培養(yǎng)基上進(jìn)行松散型愈傷組織的誘導(dǎo)，從中篩選出理想的培養(yǎng)基配方;將誘導(dǎo)出的花椰菜松散型愈傷組織轉(zhuǎn)接到不同的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，找到理想的培養(yǎng)基配方。試驗(yàn)結(jié)果表明，選用花椰菜組培苗莖段為外植體，在MS+0.5 mg·L^-1BA+1.0 mg·L^-12，4-D+30 g·L^-1蔗糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，可以獲得松散型愈傷組織;在MS+1 mg·L^-1BA+1 mg·L^-12，4-D+30 g·L^-1蔗糖的培養(yǎng)基上通過(guò)3～4次繼代培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)出花椰菜松散型胚性愈傷組織。

關(guān)鍵詞：花椰菜;外植體;胚性愈傷組織;激素

中圖分類(lèi)號(hào)：S635.3 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.05.003

Induction of Loose Embryogenic Callus in Cauliflowe

SHI Yanyu1， LIU Yanjun1， YANG Jinghui1， MU Kun2

（1.Department of ?Horticulture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China;2. Tianjin Yuanda Landscape Engineering Company Limited， Tianjin 301600， China）

Abstract： In this study， the callus was induced by different explants of cauliflower tissue culture seedlings， and the ideal explant type was selected. The induced callus was transferred to different media for the induction of loose callus; The induced cauliflower loose callus was transferred to different embryogenic callus induction medium to find the ideal medium formula. The results showed that the stem segments of cauliflower tissue culture seedlings were used as explants on MS+0.5 mg·L^-1BA+1.0 mg·L-12，4-D+30 g·L^-1sucrose medium for callus induction， and loose callus was obtained. The cauliflower loose embryogenic callus could be induced by 3～4 subcultures on MS+1 mg·L^-1BA+1 mg·L^-12，4-D+30 g·L^-1sucrose medium.

Key words： cauliflower; explants; embryogenic callus; hormone

花椰菜也叫菜花，是一種廣泛種植的蔬菜品種，其營(yíng)養(yǎng)豐富受到消費(fèi)者的普遍歡迎。近年來(lái)，有關(guān)花椰菜的育種研究較多[1-5]，培育了許多好的品種。但隨著社會(huì)的發(fā)展，對(duì)新的種質(zhì)資源需求越來(lái)越多，采用傳統(tǒng)的雜交技術(shù)已經(jīng)不能滿足育種的需求，誘變育種和基因轉(zhuǎn)化等新的育種手段相繼出現(xiàn)，這些育種技術(shù)的應(yīng)用都需要離體再生技術(shù)的輔助，因此建立高效的體細(xì)胞再生體系十分必要。

松散型胚性愈傷組織由于其結(jié)構(gòu)松散，不但可以提高誘變和轉(zhuǎn)化效率[6-11]，而且胚性愈傷組織易于再生，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的再生植株，從而加快突變株或轉(zhuǎn)化株的成苗率，為體細(xì)胞離體誘變和基因轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。本研究旨在通過(guò)選用不同外植體和不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行花椰菜松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)，建立高效的花椰菜再生體系。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)所用的花椰菜品種雪劍4號(hào)由天津市耕耘種業(yè)有限公司提供，經(jīng)過(guò)種子消毒，獲得無(wú)菌苗。在實(shí)驗(yàn)室中繼代培養(yǎng)，為試驗(yàn)提供外植體。

1.2 方 法

1.2.1 采用不同花椰菜組培苗部位為外植體誘導(dǎo)愈傷組織 在超凈臺(tái)中剪取花椰菜組培苗的葉片、葉柄和莖段作為外植體。其中葉片用剪刀前成大小2 cm的小塊，葉柄兩端造成傷口，莖段不要帶有側(cè)芽。將處理好的外植體接種到事先配制好的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基的配方為：MS+2 mg·L^-12，4-D+30 g·L^-1蔗糖，加入7 g·L^-1的瓊脂粉，pH值調(diào)節(jié)到5.8。將接過(guò)種的三角瓶放置到培養(yǎng)室中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。愈傷組織誘導(dǎo)條件為：24 h連續(xù)光照，采用1 000～2 000 Lux的光照強(qiáng)度，培養(yǎng)溫度設(shè)置為25 ℃。

1.2.2 誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基配方篩選 將前一步驟誘導(dǎo)出的花椰菜愈傷組織從外植體上切下，在培養(yǎng)皿中用解剖刀將其分割成直徑為2～3 mm大小的顆粒。將分割好的愈傷組織接種到事先配制好的含有不同激素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基編號(hào)依次為1、2、3、4、5、6、7。其具體配方為：1.MS+0.5 mg·L^-12，4-D+30 g·L^-1蔗糖;2.MS+1.0 mg·L^-12，4-D+30 g·L^-1蔗糖;3.MS+0.5 mg·L^-1BA+30 g·L^-1蔗糖;4.MS+0.5 mg·L^-12，4-D+0.5 mg·L^-1BA +30 g·L^-1蔗糖;5.MS+0.5 mg·L^-12，4-D+1 mg·L^-1BA +30 g·L^-1蔗糖;6.MS+1 mg·L^-12，4-D+0.5 mg·L^-1BA +30 g·L^-1蔗糖;7.MS+2 mg·L^-12，4-D+1 mg·L^-1BA +30 g·L^-1蔗糖。愈傷組織培養(yǎng)條件與步驟1相同，接種后大約30 d統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 花椰菜胚性愈傷組織的誘導(dǎo) 將上一步驟誘導(dǎo)出的愈傷組織在超凈臺(tái)再次進(jìn)行分割，并接種到事先配制好的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基編號(hào)依次為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17。其具體配方為：8.MS+0.5 mg·L^-12，4-D+0.5 mg·L^-1BA+30 g·L^-1蔗糖;9.MS+0.5 mg·L^-12，4-D+1 mg·L^-1BA+30 g·L^-1蔗糖;10.MS+1 mg·L^-12，4-D+0.5 mg·L^-1BA+30 g·L^-1蔗糖;11.MS+1 mg·L^-12，4-D+1 mg·L^-1BA+30 g·L^-1蔗糖;12.MS+1 mg·L-12，4-D+2 mg·L-1BA+30 g·L-1蔗糖;13.MS+0.5 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-1KT+30 g·L^-1蔗糖;14.MS+1 mg·L^-12，4-D+1 mg·L^-1KT+30 g·L^-1蔗糖;15.MS+1 mg·L^-12，4-D+2 mg·L^-1KT+30 g·L^-1蔗糖;16.MS+1 mg·L^-1BA+30 g·L^-1蔗糖;17.MS+1 mg·L^-1KT+30 g·L^-1蔗糖。在培養(yǎng)過(guò)程中采用每14 d繼代培養(yǎng)1次，繼代用培養(yǎng)基都與前面所用相同，培養(yǎng)條件為：24 h連續(xù)光照，采用2 000～3 000 Lux的光照強(qiáng)度，培養(yǎng)溫度設(shè)置為23 ℃。經(jīng)過(guò)大約3～4次繼代培養(yǎng)，對(duì)愈傷組織的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)進(jìn)行鑒定，先采用顯微鏡觀察愈傷組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，判斷愈傷組織類(lèi)型;另外采用轉(zhuǎn)接愈傷組織到無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上，通過(guò)愈傷組織的再生情況來(lái)判斷愈傷組織的胚性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體對(duì)花椰菜愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將不同花椰菜外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)7 d時(shí)間，在部分外植體的傷口部位長(zhǎng)出少量的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織的數(shù)量也在增加，經(jīng)過(guò)30 d的培養(yǎng)，大部分外植體上長(zhǎng)出了愈傷組織，具體情況見(jiàn)表1。

從表1的結(jié)果可以看出，大部分外植體都可以誘導(dǎo)出愈傷組織，說(shuō)明花椰菜容易獲得愈傷組織。從愈傷組織誘導(dǎo)率來(lái)看，除了葉片外，莖段和葉柄愈傷組織誘導(dǎo)率均為100%;從愈傷組織生長(zhǎng)速度來(lái)看，從葉片上誘導(dǎo)出的愈傷組織生長(zhǎng)速度很慢，一般是靠近葉柄部位才有少量愈傷組織長(zhǎng)出;葉柄一端誘導(dǎo)出的愈傷組織較多，愈傷組織生長(zhǎng)速度也較快，但和莖段相比，愈傷組織生長(zhǎng)速度不如莖段，說(shuō)明莖段是理想的愈傷組織誘導(dǎo)外植體。

2.2 不同激素組合對(duì)花椰菜愈傷組織生長(zhǎng)的影響

由于上一步驟誘導(dǎo)出的花椰菜愈傷組織多為白色或半透明的緊密型類(lèi)型，這類(lèi)愈傷組織生長(zhǎng)速度慢，一般很難繼續(xù)誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，為此本試驗(yàn)采用不同激素組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)這類(lèi)愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)，目的是獲得理想的愈傷組織類(lèi)型。愈傷組織經(jīng)過(guò)大約30 d的培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)基中愈傷組織的生長(zhǎng)情況明顯不同，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可以看出，不同激素配比花椰菜愈傷組織生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)質(zhì)量不同。單獨(dú)使用2，4-D時(shí)（1號(hào)和2號(hào)培養(yǎng)基）愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，誘導(dǎo)出的愈傷組織為白色緊密型愈傷組織，這類(lèi)愈傷組織很難再生和胚性化，是一種不能繼續(xù)分化的愈傷組織類(lèi)型;在2，4-D與BA的比值較低時(shí)，即高濃度的BA和低濃度的2，4-D配合使用時(shí)（3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)培養(yǎng)基），愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，愈傷組織質(zhì)地較硬，為綠色或白色愈傷組織，這類(lèi)愈傷組織雖然可以再生，但只是愈傷組織外圍少數(shù)細(xì)胞可以再生，在其內(nèi)部多數(shù)進(jìn)行組織分化，形成維管組織并纖維化，最后木質(zhì)化后細(xì)胞死亡。這類(lèi)愈傷組織也不是我們需要的類(lèi)型;在2，4-D與BA的比值較高時(shí)（6號(hào)和7號(hào)培養(yǎng)基），誘導(dǎo)出的愈傷組織生長(zhǎng)速度較快，愈傷組織結(jié)構(gòu)也變得松散，多為淡綠色愈傷組織，這類(lèi)愈傷組織一般很容易再生，可以進(jìn)一步培養(yǎng)成胚性化愈傷組織，并且其結(jié)構(gòu)松散，再生效率變得更高，這類(lèi)愈傷組織正是我們需要誘導(dǎo)的愈傷組織類(lèi)型。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，MS+0.5 mg·L^-1BA+1 mg·L^-12，4-D+30 g·L^-1蔗糖的培養(yǎng)基為理想的花椰菜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.3 不同培養(yǎng)基配方對(duì)花椰菜愈傷組織胚性化的影響

將上一步驟獲得的松散型花椰菜愈傷組織，轉(zhuǎn)接到胚性化愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織胚性化的誘導(dǎo)。經(jīng)過(guò)大約60 d時(shí)間，4次繼代培養(yǎng)，每次繼代時(shí)通過(guò)對(duì)愈傷組織的選擇，每種培養(yǎng)基獲得的愈傷組織生長(zhǎng)效果不同，具體情況見(jiàn)表3。

從表3可以看出，采用不同分裂素與2，4-D配合使用對(duì)花椰菜愈傷組織結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)速度和胚性化影響較大（8、11、13號(hào)培養(yǎng)基）。具體來(lái)看，在單獨(dú)使用分裂素時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)變慢，愈傷組織質(zhì)地變得緊密，經(jīng)過(guò)BA的處理后，愈傷組織變成綠色，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在愈傷組織表面出現(xiàn)芽原基和再生出不定芽，只是數(shù)量較少，而采用KT時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織開(kāi)始褐變并逐漸死亡。這說(shuō)明單獨(dú)使用分裂素會(huì)促進(jìn)愈傷組織提早分化，并且KT可能對(duì)花椰菜產(chǎn)生了毒害作用，不但不能促進(jìn)花椰菜愈傷組織分化，反而加快了愈傷組織老化、死亡;采用KT與2，4-D配合使用時(shí)（14、15號(hào)培養(yǎng)基），在較低濃度的KT時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)正常，只是不能出現(xiàn)胚性化，而在較高濃度的KT時(shí)，不但不能出現(xiàn)胚性化現(xiàn)象，相反，愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，變得緊密，并出現(xiàn)褐變情況，說(shuō)明KT對(duì)花椰菜胚性化沒(méi)有作用，高濃度還會(huì)造成愈傷組織褐變死亡;當(dāng)采用BA與2，4-D配合使用時(shí)，在適合的濃度配比下（1 mg·L^-1BA+1 mg·L^-12，4-D）（11號(hào)培養(yǎng)基），愈傷組織結(jié)構(gòu)松散，生長(zhǎng)速度適中，而且所有愈傷組織都呈現(xiàn)出胚性化現(xiàn)象，說(shuō)明BA是誘導(dǎo)花椰菜胚性愈傷組織的理想分裂素。因此，綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，選擇MS+1 mg·L^-1BA+1 mg·L^-12，4-D+30 g·L^-1蔗糖的培養(yǎng)基上通過(guò)3～4次繼代培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)出花椰菜胚性愈傷組織。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同分裂素與2，4-D的比值對(duì)于愈傷組織結(jié)構(gòu)特性的影響

在本試驗(yàn)中，通過(guò)采用不同分裂素與2，4-D的使用濃度的比值，可以獲得理想的愈傷組織結(jié)構(gòu)類(lèi)型，主要原理是：一般情況下，2，4-D對(duì)于愈傷組織細(xì)胞的分裂與增大生長(zhǎng)有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，并可以維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即細(xì)胞液泡較大、細(xì)胞比較薄，細(xì)胞質(zhì)濃度較低;因此，單一使用2，4-D會(huì)維持愈傷組織類(lèi)型不變，但對(duì)于細(xì)胞的分化不利。一些質(zhì)地較硬、結(jié)構(gòu)松散的愈傷組織是由一些個(gè)體較小、分裂旺盛、液泡較小，細(xì)胞壁增厚的細(xì)胞類(lèi)型組成，因此，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)姆至阉鼐蜁?huì)改變細(xì)胞的類(lèi)型，從而獲得理想的愈傷組織，但并不是簡(jiǎn)單加入分裂素就可以起到對(duì)愈傷組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行有目的的調(diào)整，應(yīng)該采用適當(dāng)?shù)谋壤?，才能控制愈傷組織不會(huì)向著極端方向轉(zhuǎn)變，如試驗(yàn)中出現(xiàn)的結(jié)果，是在適合的比值下才會(huì)獲得理想的結(jié)果。

3.2 不同分裂素種類(lèi)對(duì)愈傷組織胚性化的影響

通常情況下，在分裂素水平較高的情況下可以促進(jìn)細(xì)胞的分化，也就是可以改變愈傷組織細(xì)胞的性質(zhì)，向著胚性化方向或其他組織分化方向轉(zhuǎn)變，而2，4-D是一種維持細(xì)胞的愈傷組織特性和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的一種激素，因此，獲得胚性化的愈傷組織的必要條件就是分裂素配合一定濃度的2，4-D。但并不是所有分裂素都能促進(jìn)愈傷組織細(xì)胞的胚性化，如本試驗(yàn)中采用的KT分裂素就不能使花椰菜愈傷組織胚性化，相反還對(duì)愈傷組織有一定的毒害作用，這說(shuō)明不同植物對(duì)激素的選擇是不一樣的，通過(guò)選擇不同的分裂素，觀察其對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響來(lái)判斷選擇的正確性，因此，本試驗(yàn)采用BA可以獲得理想的花椰菜胚性愈傷組織。

通過(guò)以上試驗(yàn)，筆者獲得了雪劍菜花松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)方法，現(xiàn)將其操作步驟總結(jié)如下：選用花椰菜組培苗莖段為外植體，將其剪成小段，不帶腋芽;在MS+0.5 mg·L^-1BA+1.0 mg·L^-12，4-D+30 g·L^-1蔗糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。經(jīng)過(guò)大約30 d時(shí)間可以誘導(dǎo)出花椰菜結(jié)構(gòu)良好的愈傷組織;再將誘導(dǎo)出的愈傷組織切成小塊，在MS+1 mg·L^-1BA+1 mg·L^-12，4-D的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)3～4次繼代培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)出花椰菜胚性松散型胚性愈傷組織。

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