沙棘CAT家族基因的生物信息學(xué)分析

徐世琦　李賀　鄧伊亦　朱元玲　鄧金蘭

摘 ? ?要：CAT （Cationic amino acid transporters）是植物體內(nèi)參與氨基酸的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的一類跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。為探究CAT ? 家族基因及其所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征，本研究依據(jù)前期所獲得的不同發(fā)育期沙棘果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)功能注釋與分析后獲得3 個(gè)CAT家族成員基因，分別命名為HrCAT1、HrCAT2和HrCAT3，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，沙棘果實(shí)HrCA ?T ?家族基因均含有完整的開(kāi)放閱讀框，編碼二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主、不含信號(hào)肽的非分泌蛋白，其中HrCAT 1和HrCAT 2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)之間具有較高相似性。研究結(jié)果可為后續(xù)研究沙棘果肉HrCAT基因的表達(dá)調(diào)控提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：沙棘果實(shí); 氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體; 家族基因; 生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：S663.9 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.05.001

Bioinformatic Analysis of CAT Gene Family in Sea Buckthorn

XU Shiqi， LI He， DENG Yiyi， ZHU Yuanling， DENG Jinlan

（College of Environment and Resources， Dalian Minzu University， Dalian， Liaoning 116600， China）

Abstract： ?Cationic amino acid transporter （CAT） is involved in the uptake and transport of amino acids in plants. The aim of this paper was to study the CAT family genes and structural characteristics of encoded proteins. According to our previous RNA sequencing data from developing fruits of sea buckthorn， the genes encoding for the CAT transport proteins were functionally annotated and a total of three genes were characterized to encode for the CAT family， named as HrCAT ?1， HrCAT2 and HrCAT3， respectively. The results of bioinformatics analysis showed that all the identified HrCAT genes contained complete open-reading frame（ORF）， which could encode α-helix secondary structure， and non-secretory protein without signal peptide. There was a high similarity in tertiary structure between of HrCAT1 and HrCAT2 proteins. These results could provide a theoretical basis for further studies on the expression regulation of HrCAT genes in sea buckthorn fruit.

Key words： sea buckthorn fruit;cationic amino acid transporter;family gene; bioinformatics analysis

氨基酸是生物大分子蛋白質(zhì)的基本單位，小分子極性物質(zhì)的本質(zhì)造成其在生物體內(nèi)無(wú)法自由通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜，需要相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助才能完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。植物中的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依據(jù)基因序列的同源性可分為ATFs （the amino acid transporter family） 和 APCs （the amino acid polyamine cholinetransporter） 兩大家族[1-2] ，其中陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（CAT， Cationic amino acid transporters）屬于后者。目前，對(duì)于CAT的研究主要集中在擬南芥[3]、楊樹[4]和番茄[5]等少數(shù)植物，有關(guān)沙棘果實(shí)CAT家族基因方面研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

沙棘 （Hippophae rhamnoides L.） 是一種落葉性灌木，耐旱抗風(fēng)沙，生命力極強(qiáng)，在我國(guó)分布廣泛，常應(yīng)用于水土保持。其果實(shí)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，如必需氨基酸、維生素C、維生素E、類胡蘿卜素、不飽和脂肪酸等，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和保健品等領(lǐng)域，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6-7]。沙棘果肉中的氨基酸具有種類多和必需氨基酸較高等特點(diǎn)，是良好的植物蛋白來(lái)源[8]。因此，開(kāi)展沙棘果實(shí)發(fā)育過(guò)程中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能研究，為將來(lái)果實(shí)中功能蛋白的開(kāi)發(fā)具有重要意義。

本研究以前期獲得的不同發(fā)育期沙棘果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，挖掘CAT 家族基因成員并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)沙棘果肉中HrCAT蛋白的結(jié)構(gòu)特征和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，研究結(jié)果可為探索沙棘果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期CAT蛋白的累積規(guī)律及調(diào)控機(jī)理研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蛋白累積相關(guān)基因的篩選

對(duì)前期所獲得的不同發(fā)育時(shí)期沙棘果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因注釋、GO分析、KEGG代謝通路分析等一系列后續(xù)分析，篩選出樣品間差異表達(dá)的基因，基于這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能顯著性富集分析和Pathway顯著性富集分析，最后篩選出蛋白質(zhì)累積途徑中的CAT家族基因序列。

1.2 生物信息分析

利用各類生物信息在線工具和軟件對(duì)目的基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。篩選出HrCAT家族的核酸序列，用NCBI網(wǎng)站的在線工具ORF finder確定其開(kāi)放閱讀框，使用DNASTAR軟件將核苷酸序列轉(zhuǎn)換成氨基酸序列。之后利用ExPASy網(wǎng)站的ProtParam和ProtScale工具分析HrCAT家族基因編碼蛋白的理化特性。ProtScale在線分析中，對(duì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列及其折疊后的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析測(cè)算，結(jié)果為負(fù)值說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白，反之為疏水性蛋白。預(yù)測(cè)閾值常設(shè)定為1.6～2.0，窗口大小推薦設(shè)定為7，9，11（通常為單數(shù)）。使用SignalP[9]和TMHMM 2.0 Server[10]對(duì)蛋白中的信號(hào)肽序列和跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用SOPMA和Phyre2[11]預(yù)測(cè)HrCAT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 HrCAT家族基因的注釋及生物信息學(xué)分析

對(duì)沙棘轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋與篩選，獲得了CAT家族基因中的3個(gè)成員，分別命名為HrCAT ?1、HrCAT ? 2和HrCAT ?3。通過(guò)NCBI網(wǎng)站上的 ORF finder 工具，分析3種 HrCAT ? 基因的核酸序列。結(jié)果表明，3種HrCAT 基因分別具有長(zhǎng)度為3 646，1 373，2 387 bp的完整開(kāi)放閱讀框（open reading frame， ORF），分別編碼 540，353，648個(gè)氨基酸，表明3種 HrCAT 基因均具有編碼完整基因的獨(dú)立性（表1）。疏水性總體平均值分別為0.547，0.429和0.557，屬于疏水性蛋白。

2.2 HrCAT家族基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

利用ProtParam工具分析后可知，3種HrCAT基因編碼的蛋白具有相似的分子式，不穩(wěn)定指數(shù)均為Ⅱ級(jí)，表現(xiàn)為穩(wěn)定蛋白。預(yù)測(cè)6種HrCAT基因所編碼蛋白的分子量分別為137.90，88.87，162.91 kD，理論等電點(diǎn)為5.01，5.15，4.97 （表2）。

2.3 HrCAT家族蛋白信號(hào)肽和跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)

應(yīng)用SignalP.4.1對(duì)PsCAT家族蛋白進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種HrCAT蛋白的C值和Y值均小于+1，S值無(wú)明顯變化，且無(wú)明顯的信號(hào)肽特征（圖1），表明3種HrCAT蛋白均不含信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。

利用TMHMM 2.0 Server進(jìn)行HrCAT家族蛋白的跨膜區(qū)分析，結(jié)果顯示，HrCAT1、HrCAT2和HrCAT3分別含有14個(gè)、10個(gè)和14個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，均屬于跨膜蛋白（圖2）。預(yù)測(cè)結(jié)果與疏水性結(jié)果分析一致，表明3個(gè)蛋白均為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，承擔(dān)氨基酸在膜內(nèi)外的運(yùn)輸工作。

2.4 HrCAT家族蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

應(yīng)用在線工具SOPMA預(yù)測(cè)PsCAT家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（表3）。通過(guò)比較分析后發(fā)現(xiàn)，3種HrCAT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲4種結(jié)構(gòu)元件組成，其中α-螺旋所占比例均為最高、其次為無(wú)規(guī)卷曲，β-折疊所占比例最少，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)類型的分類方法，3種HrCAT蛋白均屬于混合型蛋白，且二級(jí)結(jié)構(gòu)彼此之間具有較高相似性。另外，3種HrCAT蛋白中均含有較高比例的無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，而無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)常受側(cè)鏈影響從而構(gòu)成蛋白質(zhì)的活性部位[12-13]。

通過(guò)Phyre2服務(wù)器同源構(gòu)建模型預(yù)測(cè)PsCAT蛋白的三維結(jié)構(gòu)[14]，經(jīng)序列對(duì)比分析后，分別以C4DJIA蛋白和C4M57A蛋白的核磁模型為模板構(gòu)建模型。結(jié)果表明，在3種HrCAT蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)中占比最多的均為α-螺旋，其次為無(wú)規(guī)卷曲，這與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。另外，HrCAT1和HrCAT2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)之間具有較高相似性，二者與HrCAT3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)的相似度較低（圖3）。

3 結(jié)論與討論

CAT是一類堿性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于 APCs 家族，主要參與植物體內(nèi)氨基酸的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)。近年來(lái)，在擬南芥和楊樹中已發(fā)現(xiàn)多個(gè)CAT 家族成員，CAT家族基因的調(diào)控與表達(dá)水平，突變體功能缺失等方面已成為研究熱點(diǎn)[15]。由于蛋白質(zhì)累積過(guò)程中調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，CAT 調(diào)控蛋白相關(guān)功能基因表達(dá)的分子機(jī)制尚不明確，蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)解析等方面鮮有報(bào)道。本研究中采用生物信息學(xué)方法對(duì)沙棘果實(shí)HrCAT ? 家族所編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能等方面進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)，探索植物CAT家族蛋白的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)。

沙棘果實(shí)中HrCAT ? 家族編碼蛋白均含有跨膜區(qū)，這與其吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能密切相關(guān)。二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，HrCAT家族基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲3種結(jié)構(gòu)組成，HrCAT1和HrCAT2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)具有較高的相似度。這揭示沙棘果肉中的HrCAT1和HrCAT2基因在功能方面可能具有較高的相似性，而HrCAT3蛋白初步推測(cè)可能具有某些特異性功能。推測(cè)沙棘果肉中的3種CAT基因在調(diào)控不同種類氨基酸的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)發(fā)揮的功能存在多樣性與特異性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索沙棘果肉蛋白的累積規(guī)律及調(diào)控機(jī)理提供科研依據(jù)與基礎(chǔ)，具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用前景。

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