p16蛋白在宮頸癌中的表達(dá)及其與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系

李偉英，范長玲，張敏，陳月芳

儋州市人民醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2病理科，3檢驗(yàn)科，海南 儋州5717990

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，大多數(shù)患者確診時已是宮頸浸潤癌。宮頸浸潤癌多見于圍絕經(jīng)期婦女[1]。近年來，宮頸癌的發(fā)病率逐漸升高，且呈現(xiàn)年輕化趨勢[2]。宮頸細(xì)胞學(xué)檢查等篩查方法能夠發(fā)現(xiàn)大量的早期宮頸病變，是預(yù)防宮頸癌的有效方法。影像學(xué)檢查能夠?qū)m頸病變的范圍和浸潤情況進(jìn)行評估。目前，腫瘤基因?qū)W是臨床研究和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制基因p16的活性與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[3]。本研究擬探討p16蛋白與宮頸癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床診療宮頸癌提供參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2010年10月至2015年10月儋州市人民醫(yī)院收治的116例宮頸癌患者，所有患者的宮頸癌組織標(biāo)本均經(jīng)活檢或手術(shù)采集。所有患者明確病理性質(zhì)后均采取宮頸癌根治術(shù)，并根據(jù)宮頸癌分期決定是否采取術(shù)后放化療。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床診斷為宮頸癌，并經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)；均為初診，且參與本研究前未行放療或化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞70歲；存在子宮先天畸形；合并其他部位惡性腫瘤。116例宮頸癌患者的年齡為26～62歲，平均年齡為（43.52±7.25）歲；病理類型：鱗癌46例，腺癌38例，腺鱗癌32例；宮頸癌分期：Ⅰ期62例，Ⅱ期54例；分化程度：低分化38例，中高分化78例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移79例。另選取100例行子宮全切術(shù)且無宮頸病變的子宮肌瘤患者的正常宮頸組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床擬診為子宮肌瘤，并經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：子宮肌瘤累及宮頸，存在宮頸病變；存在子宮先天畸形；合并其他部位惡性腫瘤。子宮肌瘤患者的年齡為35～69歲，平均年齡為（44.13±6.55）歲。兩組患者的年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》，向所有患者及其家屬介紹了研究的目的、方法及注意事項(xiàng)，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接（streptavidin-perosidase，SP）法檢測p16蛋白的表達(dá)情況。所有組織標(biāo)本采用10%福爾馬林固定，常規(guī)取材，石蠟包埋，將蠟塊以4 μm厚度進(jìn)行切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，微波修復(fù)抗原，蒸餾水沖洗后加鼠抗人p16單克隆抗體（購自武漢博士德生物工程有限公司）和存活蛋白（survivin）單克隆抗體（購自美國Labvision公司），4℃孵育12 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次5 min，加入50 μl二抗（羊抗鼠抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司），25℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，室溫下滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑（購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）顯色3～5 min，自來水沖洗，終止顯色，PBS浸洗3次，每次2 min，蘇木素復(fù)染1～2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于BX41高倍鏡下閱片并拍攝。以PBS代替血清為陰性對照，已知陽性切片為陽性對照，對p16蛋白表達(dá)情況進(jìn)行判定。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)及觀察指標(biāo)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]評價p16蛋白的陽性結(jié)果：p16蛋白陽性定位主要在細(xì)胞核，也可定位在細(xì)胞質(zhì)，陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比分為陰性（-）（＜25%）、弱陽性（+）（25%～50%）、中等陽性（++）（51%～70%）和強(qiáng)陽性（+++）（＞70%）。其中，“+～+++”定義為p16蛋白陽性表達(dá)。綜合陽性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)弱進(jìn)行評價，陰性：陽性細(xì)胞所占百分比＜25%，染色較淡；陽性：陽性細(xì)胞所占百分比≥25%，染色較深。觀察和比較宮頸癌組織和正常宮頸組織中p16蛋白的表達(dá)情況，分析p16蛋白表達(dá)與宮頸癌患者臨床特征（包括患者的年齡、腫瘤直徑、病理類型、宮頸癌分期、宮頸癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況）的關(guān)系，觀察p16蛋白表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系。采用定期門診或電話隨訪的方式對患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止日期為2018年12月，隨訪1～92個月，中位隨訪時間為60個月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織和正常宮頸組織中p16蛋白表達(dá)情況的比較

宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達(dá)率為89.66%（104/116），明顯高于正常宮頸組織的9.00%（9/100），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=140.043，P＜0.01）。（表 1）

表1 不同宮頸組織中 p16蛋白的表達(dá)情況[ n（%）]

2.2 p16蛋白的陽性表達(dá)情況與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系

不同年齡、腫瘤直徑、病理類型、宮頸癌分期宮頸癌患者宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達(dá)率均高于分化程度為中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

2.3 p16蛋白表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系

p16蛋白陰性表達(dá)宮頸癌患者共12例，其中，因腫瘤復(fù)發(fā)死亡1例，p16蛋白陰性表達(dá)患者的3年生存率為91.7%。p16蛋白陽性表達(dá)宮頸癌患者共104例，其中，因腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移死亡39例，p16蛋白陽性表達(dá)患者的3年生存率為62.5%。經(jīng)Logrank檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，p16蛋白陰性表達(dá)患者的生存情況優(yōu)于p16蛋白陽性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.896，P＜0.05）。（圖1）

表2 p16蛋白陽性表達(dá)與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系（ n=116）

圖1 p16蛋白陰性表達(dá)（ n=12）和陽性表達(dá)（ n=104）宮頸癌患者的生存曲線

3 討論

盡管正常宮頸組織進(jìn)展為宮頸癌的時間長達(dá)8～12年，但宮頸癌患者預(yù)后較差，中國每年約有2萬女性死于宮頸癌[4]。早期篩查和早期治療宮頸癌一直是提高臨床治愈率、降低病死率的關(guān)鍵[5]。p16是調(diào)控細(xì)胞周期的蛋白，參與細(xì)胞的增殖和分裂過程[6]。p16蛋白表達(dá)異?；蚧钚援惓?dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性增殖，有研究證實(shí)p16蛋白參與肺癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[7]。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織（P＜0.01），提示p16蛋白的陽性表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，通過干預(yù)p16蛋白的表達(dá)可能抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。p16蛋白通過競爭性結(jié)合細(xì)胞周期依賴性激酶調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制惡變細(xì)胞的增殖和分化，防止惡性腫瘤的發(fā)生[8-9]，當(dāng)p16基因失活時，p16蛋白的表達(dá)活性下降，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂、細(xì)胞癌變[10-13]。p16蛋白在宮頸鱗狀上皮癌前病變及柱狀上皮癌前病變和宮頸癌組織中均有廣泛表達(dá)，相關(guān)報(bào)道顯示p16蛋白在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)與人乳頭狀瘤病毒2級（human papilloma virus，HPV）感染有關(guān)，HPV能夠?qū)е聀Rb蛋白失活，從而刺激p16蛋白的表達(dá)水平升高[14-15]。p16蛋白檢測可鑒別宮頸上皮內(nèi)瘤變2級（cervical intraepithelial neoplasia 2，CIN2）、宮頸鱗癌和子宮內(nèi)膜鱗癌，也可鑒別宮頸腺癌和子宮內(nèi)膜腺癌，大大提高了對宮頸癌癌前病變的診斷準(zhǔn)確率[16-17]。

本研究分析了p16蛋白與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達(dá)率均明顯高于中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，提示p16蛋白不僅參與宮頸癌的發(fā)生，還參與宮頸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的發(fā)展過程。但是本研究未發(fā)現(xiàn)p16蛋白陽性表達(dá)與宮頸癌患者年齡、腫瘤直徑、病理類型、宮頸癌分期的關(guān)系，推測其原因可能與本研究患者年齡普遍偏低有關(guān)。然而，有大量研究發(fā)現(xiàn)p16蛋白的陽性表達(dá)與宮頸癌患者的年齡有關(guān)，年齡越大，p16蛋白的陽性表達(dá)率越高，分析原因可能與年齡的分層標(biāo)準(zhǔn)存在差異有關(guān)[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，p16蛋白陽性表達(dá)患者和p16蛋白陰性表達(dá)患者的生存情況表現(xiàn)出明顯的差異，p16蛋白陽性表達(dá)患者的生存率較低，提示p16蛋白是宮頸癌患者不良預(yù)后的預(yù)測因子。

綜上所述，宮頸癌組織中p16蛋白的陽性表達(dá)率較高，其陽性表達(dá)可能與宮頸癌患者的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，p16蛋白陰性表達(dá)患者的生存情況更優(yōu)，p16蛋白可作為評價宮頸癌患者病情和預(yù)后的有效指標(biāo)。本研究尚存在諸多不足之處，如本研究納入的樣本量較少，且對患者的隨訪時間較短，因此有待日后擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步深入且長期的研究。