上調(diào)miRNA-145表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡及放射敏感性的影響

王亞飛，宋長亮，張振軍，楊瓊，楊庚武，張磊，田云霄，宋小天

邯鄲市中心醫(yī)院1腫瘤科，3病理科，河北 邯鄲056000

2邯鄲市骨科醫(yī)院骨科，河北 邯鄲056000

4河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，石家莊0500170

肺癌是全球疾病致死的最主要原因，是一種侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力很強(qiáng)的惡性腫瘤。大部分肺癌患者就診時(shí)已處于中晚期，5年生存率很低，預(yù)后效果極差，嚴(yán)重威脅著人們的健康[1]。非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率約占肺癌的85%[2-3]，是一種中度放療敏感的惡性腫瘤。隨著醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，近幾年臨床上針對(duì)非小細(xì)胞肺癌的放療取得了突出成績，放療已逐漸成為中晚期非小細(xì)胞肺癌治療的有效手段之一，但是由部分患者在治療的中后期出現(xiàn)抗輻射效應(yīng)，放療效果并不理想。因此，如何提高放射敏感性備受學(xué)術(shù)界的關(guān)注。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類短小、非編碼RNA，在維持機(jī)體自身穩(wěn)態(tài)、免疫應(yīng)答、生長發(fā)育和新陳代謝等過程中發(fā)揮重要的作用。大量的研究表明，miRNA能夠影響腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[4-6]。其中，關(guān)于miRNA-145的研究較多，其在多種腫瘤組織或細(xì)胞中低表達(dá)，與腫瘤的增殖、凋亡等生理過程密切相關(guān)[7-8]。有研究報(bào)道，miRNA-145還能夠增強(qiáng)宮頸癌等腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[9]，但其在非小細(xì)胞肺癌中的作用及其對(duì)腫瘤細(xì)胞放射敏感性的研究報(bào)道較少。本研究分析了miRNA-145在A549細(xì)胞中的表達(dá)情況，并探討了干擾其表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖、凋亡的作用及其對(duì)細(xì)胞放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑儀器

人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基、青鏈霉素和胎牛血清均購于美國Hyclone公司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒均購于美國Invitrogen公司。miRNA-145模擬物（miRNA-145 mimic）、miRNA-145陰性對(duì)照（control miRNA）質(zhì)粒、內(nèi)參U6引物和miRNA-145引物均購于廣州銳博生物科技技術(shù)有限公司。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連TaKaRa公司，總RNA提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。四甲基偶氮唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑和膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀購于美國BD公司。凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）儀均購于美國BioRad公司。核酸濃度檢測儀（NanoDrop 2000c）購于美國Thermo Scientific公司。醫(yī)用加速器購于美國Varian公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出保存的BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞，迅速置于37℃水浴鍋中解凍復(fù)蘇后，接種到RPMI1640培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+0.1 mg/ml鏈霉素）中，在37℃、5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，以105/ml細(xì)胞密度，每孔2 ml接種于6孔細(xì)胞板上，將其隨機(jī)分為miRNA-145組、NC組和對(duì)照組3組。次日，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將終濃度為80 nmol/L的miRNA-145模擬物轉(zhuǎn)染至miRNA-145組細(xì)胞中，miRNA-145陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NC組細(xì)胞中，對(duì)照組細(xì)胞只加入轉(zhuǎn)染試劑。采用RT-PCR檢測各組細(xì)胞中miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量以評(píng)價(jià)其轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3 RT-PCR檢測miRNA-145表達(dá)情況 收集生長良好的BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞，以總RNA提取試劑盒提取總RNA，NanoDrop 2000c檢測RNA的純度和濃度。采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后，進(jìn)行PCR。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性300 （s1個(gè)循環(huán)）；95℃變性30 s，60℃退火30 s和72℃延伸120 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃總延伸360 s（1個(gè)循環(huán)）。每組重復(fù)3次。內(nèi)參基因?yàn)閁6，采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量。1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 收集對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml后接種于96孔板上，于CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。次日，將其按照1.2.2中的步驟進(jìn)行分組與轉(zhuǎn)染，分別在處理24、48、72 h時(shí)收集各組細(xì)胞，加入MTT溶液，孵育4 h后，再加入二甲基亞砜，反應(yīng)20 min，采用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測各組細(xì)胞的光密度（optical density，OD）值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 收集轉(zhuǎn)染48 h生長良好的對(duì)照組、NC組和miRNA-145組細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后制成濃度為105/ml的細(xì)胞懸液。根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，依次加入 Annexin V-FITC 5 μl和 PI 10 μl，振蕩混勻，37℃下避光培養(yǎng)15 min，通過流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測各組細(xì)胞的凋亡率。每組重復(fù)3次。

1.2.6 細(xì)胞放射敏感性檢測 收集生長良好的對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于6孔板上，隨機(jī)分為2組，以轉(zhuǎn)染miRNA-145模擬物的細(xì)胞為miRNA-145組，以未做處理的細(xì)胞為對(duì)照組。常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，兩種細(xì)胞均給予劑量為2、4、6、8 Gy的6MV X線進(jìn)行照射。照射條件：劑量率為100 cGy/min，照射源-皮距（source-skin distance，SSD）為100 cm。照射結(jié)束后，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的放射敏感性。更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，以冷甲醇固定，姬姆薩溶液染色。在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，以大于50個(gè)細(xì)胞為有效克隆。以單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，經(jīng)GraphPad Prism 7軟件生成平均致死劑量（mean lethal dose，簡稱 D0）、準(zhǔn)域劑量（quasi-domain dose，Dq）、外推數(shù)（N）、2 Gy照射后的存活分?jǐn)?shù)（survival fraction at 2 Gy，SF2）和放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）等參數(shù)值。每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-145的表達(dá)情況

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，A549細(xì)胞中miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量為（0.08±0.03），明顯低于正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞的（1.02±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=27.92，P＜0.01）。將miRNA-145模擬物和miRNA-145陰性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞后，miRNA-145組、NC組、對(duì)照組細(xì)胞中miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量分別為（13.53±1.25）、（0.95±0.08）、（1.03±0.06），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=300.01，P＜0.01）；NC組和對(duì)照組細(xì)胞中miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；miRNA-145組細(xì)胞中 miRNA-145的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.146，P＜0.05）。

2.2 A549細(xì)胞的增殖情況

對(duì)照組、NC組、miRNA-145組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48、72 h的OD值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同一作用時(shí)間點(diǎn)，miRNA-145組細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t24h=2.887、t48h=4.070、t72h=3.203，P＜0.05），而NC組與對(duì)照組細(xì)胞的OD值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞OD值的比較

2.3 A549細(xì)胞的凋亡情況

轉(zhuǎn)染48 h后，對(duì)照組、NC組和miRNA-145組細(xì)胞的凋亡率分別為（7.45±0.74）%、（8.26±0.82）%和（16.13±1.60）%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=54.736，P＜0.01）；NC組與對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；miRNA-145組細(xì)胞的凋亡率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.471，P＜0.05）。（圖1）

圖1 FCM法檢測A549細(xì)胞的凋亡情況

2.4 上調(diào)miRNA-145表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞放射敏感性的影響

以2、4、6、8 Gy不同劑量的X線照射對(duì)照組和miRNA-145組細(xì)胞，根據(jù)打擊多靶模型擬合A549細(xì)胞的存活曲線，結(jié)果顯示，不同劑量的X線照射后miRNA-145組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)（survival fraction，SF）均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖 2）。miRNA-145組細(xì)胞的D0、Dq、N、SF2分別為1.439 Gy、1.292 Gy、2.454、0.505，對(duì)照組細(xì)胞的 D0、Dq、N、SF2分別為 2.146 Gy、2.262 Gy、2.869、0.762。上調(diào)miRNA-145表達(dá)后A549細(xì)胞的SER為1.491。

圖2 打擊多靶模型擬合 A549細(xì)胞的存活曲線

3 討論

miRNA-145位于人類5q32染色體上，是一種高度保守的RNA，具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體，經(jīng)相關(guān)酶切后可形成由21個(gè)堿基組成的成熟miRNA-145[10-11]。miRNA-145在腫瘤組織或細(xì)胞中異常低表達(dá)，其作為抑癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Lu等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-145在腎癌組織中表達(dá)下調(diào)，恢復(fù)其表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移過程明顯受到抑制，且細(xì)胞凋亡顯著增加。王寰昱等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miRNA-145表達(dá)能有效抑制肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。近年來，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)miRNA-145在非小細(xì)胞肺癌患者的組織和血清中低表達(dá)，與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。但miRNA-145表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡關(guān)系的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞比較，miRNA-145在A549細(xì)胞中低表達(dá)；以脂質(zhì)體法上調(diào)其表達(dá)后，同一作用時(shí)間點(diǎn)，miRNA-145組細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組，細(xì)胞的增殖能力受到抑制；而轉(zhuǎn)染48 h后miRNA-145組細(xì)胞的凋亡率高于對(duì)照組，細(xì)胞的凋亡能力增強(qiáng)。提示上調(diào)miRNA-145表達(dá)可通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡來抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。

放療是非小細(xì)胞肺癌中晚期常用的一種治療方法，主要是通過放射線的輻射能量作用于DNA分子，引起DNA損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而起到治療非小細(xì)胞肺癌的作用[15]。miRNA在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[16]。miRNA-145是miRNA中的重要一員，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞放射敏感性方面發(fā)揮著重要的作用。Ye等[17]的研究結(jié)果顯示，miRNA-145在宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低，過表達(dá)miRNA-145可通過靶向DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因解旋酶樣轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)體內(nèi)和體外宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性。同時(shí)，Yan等[18]還發(fā)現(xiàn)miRNA-145可通過下調(diào)八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄 因 子 4（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）的表達(dá)增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性。Gong等[19]在前列腺癌小鼠模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，異常高表達(dá)的miRNA-145可增強(qiáng)輻射對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。為了進(jìn)一步探討miRNA-145對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的放射敏感性，本研究以不同放射劑量照射A549細(xì)胞后，經(jīng)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，miRNA-145組細(xì)胞的 D0、Dq、N、SF2均低于對(duì)照組，上調(diào)miRNA-145表達(dá)后A549細(xì)胞的SER為1.491。結(jié)果提示，上調(diào)miRNA-145表達(dá)可增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的輻射殺傷作用。

綜上所述，miRNA-145在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量較低，上調(diào)其表達(dá)能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。本研究結(jié)果豐富了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生機(jī)制，同時(shí)也為以miRNA-145為靶點(diǎn)的非小細(xì)胞肺癌放療的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。然而，miRNA-145調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展及放射敏感性的分子機(jī)制十分復(fù)雜，有待進(jìn)一步深入研究。