堿法預(yù)處理玉米芯糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化酒精工藝優(yōu)化

劉 彬，連 戰(zhàn)，劉仲洋，趙榮文，楊 莉，張秀爽，譚麗萍，劉同軍*

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353）

玉米是我國(guó)重要的糧食作物，種植廣泛。玉米的大范圍種植也產(chǎn)生了以玉米秸稈、玉米芯為代表的數(shù)量龐大的農(nóng)業(yè)廢棄物[1]。據(jù)農(nóng)業(yè)部調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)每年玉米秸稈產(chǎn)量高達(dá)2.65億t，玉米芯的年產(chǎn)量4 000萬(wàn)t以上，合理利用這些廢棄物尤為重要[2-3]。

玉米芯中有較高的纖維素與半纖維素含量[3-5]，經(jīng)一定預(yù)處理及酶解后可有效實(shí)現(xiàn)玉米芯轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖及燃料乙醇的目的[6-8]。不同預(yù)處理方法預(yù)處理效果不同[9-11]，利用堿過(guò)氧化氫（alkaline hydrogen peroxide，AHP）法預(yù)處理能有效破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)[12-13]，增加纖維素酶素與纖維素的有效接觸和催化水解率[14-15]，提高纖維素及半纖維素酶解效率。同時(shí)，選擇合適的體系、pH有助于促進(jìn)纖維素酶與半纖維素酶的催化作用[16-17]，提高酶解轉(zhuǎn)化率。此外，不同的發(fā)酵方式會(huì)對(duì)酒精產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率造成很大的影響[18-19]。本研究在堿過(guò)氧化氫法預(yù)處理的技術(shù)上，對(duì)酶解pH、底物濃度、酶解溫度及酶解時(shí)間等影響玉米芯糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化酒精工藝的因素進(jìn)行探討，并對(duì)玉米芯發(fā)酵產(chǎn)酒精不同方式的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，旨在為玉米芯發(fā)酵酒精提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米芯：山東德州龍力生物科技有限公司；硫酸、過(guò)氧化氫（H2O2）（均為分析純）：萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；NaOH（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；纖維素酶（192 mg/mL）：丹麥諾維信公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10 pH計(jì)：德國(guó)賽多利斯公司；MQD-B3NR恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海旻泉儀器有限公司；LC-20A液相色譜儀：日本島津公司；DHG-9075A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；5804R離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；SQ510C滅菌鍋：日本Yamato公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 堿法預(yù)處理玉米芯糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化酒精工藝流程

玉米芯→粉碎→熱水處理→堿處理→酶解→發(fā)酵

1.3.2 操作要點(diǎn)

玉米秸稈熱水處理：稱取一定量玉米芯于1000mL三角瓶中，設(shè)計(jì)底物濃度為10%，稱取3.00g NaOH顆粒于燒杯中，用10mL蒸餾水溶解，攪拌均勻后將NaOH溶液倒入三角瓶，添加蒸餾水290 mL。置于80℃水浴鍋中浸提60 min，之后去掉液體部分，固體部分用蒸餾水沖洗至中性，風(fēng)干備用。

堿過(guò)氧化氫預(yù)處理：設(shè)計(jì)底物濃度為10%，稱取一定量經(jīng)熱水處理的玉米芯于50 mL三角瓶中。稱取0.30 g NaOH顆粒于燒杯中，10mL蒸餾水溶解，加入0.9mL 30%H2O2溶液（添加量0.1 g/g玉米芯），混勻后倒入三角瓶中，繼續(xù)加入蒸餾水19.1 mL。置于30℃、170 r/min條件下振搖24 h，每隔2 h用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)一次，使pH保持在11.7～11.9。

酶解：稱取3.0 g玉米芯于50 mL三角瓶中，堿預(yù)處理后用72%H2SO4調(diào)節(jié)酶解初始pH，添加一定量纖維素酶，在一定酶解溫度條件下酶解一定時(shí)間。

發(fā)酵：準(zhǔn)確稱取15.0 g熱水處理玉米芯，堿預(yù)處理后加入0.5%蛋白胨，115℃滅菌20 min，添加一定量纖維素酶，在一定酶解溫度條件下酶解一定時(shí)間，接種干酵母，置于一定溫度條件下發(fā)酵一定時(shí)間。

1.3.3 玉米芯酶解工藝優(yōu)化

（1）玉米芯酶解加酶量的選擇

稱取3.0g玉米芯于50mL三角瓶中，堿預(yù)處理完畢后用72%H2SO4調(diào)節(jié)pH至5.0，纖維素酶的添加量分別為5 mg/g、10mg/g、15mg/g、20mg/g、30mg/g、50mg/g，50℃酶解24h，考察酶添加量對(duì)葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響。

（2）玉米芯酶解初始pH的選擇

稱取3.0 g玉米芯于50 mL三角瓶中，堿預(yù)處理完畢后分別調(diào)節(jié)初始pH至4.6、4.8、5.0、5.2、5.5，纖維素酶添加量為20 mg/g，50℃酶解24 h，考察酶初始pH對(duì)葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響。

（3）玉米芯酶解不同底物濃度的選擇

稱取3.0 g玉米芯于50 mL三角瓶中，堿預(yù)處理后用72%H2SO4調(diào)節(jié)初始pH至5.2，添加纖維素酶20 mg/g，分別在酶解底物濃度為5%、10%、15%、20%、25%、30%條件下，50℃酶解24 h，考察酶解底物濃度對(duì)葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.5 不同發(fā)酵方式對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響

分步發(fā)酵：稱取熱水處理玉米芯玉米芯15.0 g，按照上述實(shí)驗(yàn)方法酶解后，離心去除固形物。上清液加0.5%蛋白胨后115℃滅菌20 min，干酵母接種量為底物質(zhì)量的5%，置于30℃、170 r/min條件下振蕩發(fā)酵80 h，測(cè)定葡萄糖、木糖及乙醇產(chǎn)量并計(jì)算其轉(zhuǎn)化率。

半同步發(fā)酵：準(zhǔn)確稱取15.0 g熱水處理玉米芯，堿預(yù)處理后加入0.5%蛋白胨115℃滅菌20 min，加酶20 mg/g纖維素50℃酶解4 h后，按照底物質(zhì)量的5%接種干酵母，置于30℃、170 r/min條件下振蕩發(fā)酵80 h，測(cè)定葡萄糖、木糖及乙醇產(chǎn)量并計(jì)算其轉(zhuǎn)化率。

同步發(fā)酵：準(zhǔn)確稱取15.0 g熱水處理玉米芯，堿預(yù)處理后加入0.5%蛋白胨115℃滅菌20 min。加酶20 mg/g纖維素，干酵母接種量為底物質(zhì)量的5%，置于30℃、170 r/min發(fā)酵條件下振蕩發(fā)酵80 h，測(cè)定葡萄糖、木糖及乙醇產(chǎn)量并計(jì)算其轉(zhuǎn)化率。

1.3.6 分析檢測(cè)

纖維素、半纖維素及木質(zhì)素測(cè)定參照美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（National Renewable Energy Laboratory，NREL）的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)《生物質(zhì)中結(jié)構(gòu)碳水化合物和木質(zhì)素的測(cè)定》[20]；葡萄糖、木糖及乙醇濃度使用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定，其色譜條件為：色譜柱Aminex-87 H色譜柱（300 mm×7.8 mm），檢測(cè)器為示差-折光檢測(cè)器，流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4，柱溫65℃，流速0.6 mL/min，通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程對(duì)糖濃度及乙醇濃度進(jìn)行計(jì)算，葡萄糖、木糖及乙醇轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下：

式中：X、Y、Z分別為葡萄糖、木糖及乙醇轉(zhuǎn)化率，%；C1、C2、C3分別為葡萄糖、木糖及乙醇質(zhì)量濃度，g/L；V為樣品體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；w1為纖維素含量，%；w2為半纖維素含量，%；0.9為纖維素轉(zhuǎn)換為葡萄糖的轉(zhuǎn)化系數(shù)；0.88為半纖維素轉(zhuǎn)換為木糖的轉(zhuǎn)化系數(shù)；0.511為葡萄糖轉(zhuǎn)換為乙醇的轉(zhuǎn)化系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米芯成分分析

玉米芯成分分析的結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 玉米芯成分分析Fig.1 Composition analysis of corncob

由圖1可知，玉米芯纖維素含量為38.05%，半纖維素含量為28.41%，酸不溶性木質(zhì)素含量為25.85%，此外，還有4.24%灰分及1.19%其他成分。該結(jié)果與其他的一些研究[21]得出的玉米芯成分接近。與玉米秸稈相比，玉米芯纖維素及半纖維素含量更高，不同地區(qū)、玉米的品種、成分分析的方式等差異均能導(dǎo)致玉米芯成分之間的差異[22]。

2.2 熱水處理玉米芯成分分析

按照1.3.2節(jié)中方法熱水處理玉米芯，分析熱水處理前后其成分的變化，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 熱水處理前后玉米芯成分分析比較Fig.2 Comparison of corncob composition analysis before and after hot water treatment

由圖2可知，熱水處理之后的玉米芯成分相對(duì)于未處理的玉米芯成分有很大的變化，纖維素含量為48.72%，半纖維素含量為40.37%，相對(duì)含量分別提高了28%和42%，而木質(zhì)素的相對(duì)含量降低至6.6%左右。因?yàn)闊崴幚磉^(guò)程破壞了玉米芯中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素之間致密的連接，打破了“鋼筋混凝土”的框架，結(jié)構(gòu)變得疏松從而增加了比表面積，更利于之后的預(yù)處理和酶解過(guò)程；另一方面，熱水處理之后，水洗可以去掉預(yù)處理液中大部分抑制物，因此可以大大提高酶解效率和乙醇產(chǎn)量。

2.3 玉米芯酶解條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 玉米芯酶解加酶量的確定

不同纖維素酶添加量對(duì)酶解效率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同纖維素酶添加量對(duì)葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of different cellulase addition on conversion rate of glucose and xylose

由圖3可知，葡萄糖與木糖酶解趨勢(shì)基本一致。當(dāng)纖維素酶添加量在5～20 mg/g時(shí)，葡萄糖轉(zhuǎn)化率隨加酶量增加逐漸升高，當(dāng)加酶量高于20 mg/g后轉(zhuǎn)化率趨于平穩(wěn)，并在酶添加量為50 mg/g時(shí)葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值為80.60%，與酶添加量為20 mg/g時(shí)葡萄糖轉(zhuǎn)化率（77.83%）相比提高較?。欢?dāng)加酶量在5～30 mg/g時(shí)，木糖轉(zhuǎn)化率隨加酶量增加逐漸升高，加酶量高于30 mg/g后趨于平穩(wěn)，并且葡萄糖轉(zhuǎn)化率高于木糖轉(zhuǎn)化率。實(shí)驗(yàn)中所用酵母只能利用葡萄糖，所以只考慮葡萄糖轉(zhuǎn)化率即可。因此，選擇纖維素酶最適添加量為20 mg/g。

2.3.2 玉米芯酶解初始pH的確定

不同酶解初始pH對(duì)酶解效率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，酶解初始pH值為5.2時(shí)葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值：葡萄糖轉(zhuǎn)化率為79.77%，比初始pH 4.8、pH 5.0和pH 5.5分別高出1.15%、0.5%和3.16%；木糖轉(zhuǎn)化率為75.01%，較初始pH 4.8、pH 5.0和pH 5.5分別高出1.24%、2.6%和3.18%。結(jié)果表明，酶解pH值為5.2時(shí)更有利于纖維素酶催化活性的發(fā)揮。因此，選擇最適酶解初始pH值為5.2。

圖4 不同酶解初始p H值對(duì)葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of different enzymolysis initial pH on conversion rate of glucose and xylose

2.3.3 酶解底物濃度的確定

不同底物濃度對(duì)酶解效率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著底物濃度在5%～30%范圍內(nèi)提高，葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率逐漸下降，且下降趨勢(shì)呈非線性關(guān)系。在5%底物濃度下，葡萄糖及木糖轉(zhuǎn)化率分別為88.74%、82.89%，但葡萄糖與木糖濃度則分別為17.73 g/L、12.65 g/L，處于相對(duì)較低的水平。10%底物濃度時(shí)，葡萄糖和木糖濃度較高，其轉(zhuǎn)化率與底物濃度為5%時(shí)相差不大。底物濃度提高至20%時(shí)，而葡萄糖與木糖濃度則分別達(dá)到了56.41 g/L、40.08 g/L，處于相對(duì)較高的水平，但葡萄糖及木糖轉(zhuǎn)化率降低至71.12%，66.17%。底物濃度升高，轉(zhuǎn)化率降低是因?yàn)轶w系水分活度的降低，不利于傳質(zhì)作用，酶蛋白不能和底物充分接觸；另外底物濃度提高會(huì)導(dǎo)致酶抑制物濃度的升高及高糖產(chǎn)物的反饋抑制，從而纖維素酶酶活降低，最終影響轉(zhuǎn)化率。這與之前的研究[3，23]，玉米秸稈不同底物濃度下酶解液葡萄糖與木糖濃度及轉(zhuǎn)化率趨勢(shì)基本一致，但是糖轉(zhuǎn)化率稍有不同，可能是因?yàn)樵虾驮项A(yù)處理方法不同造成的。因此，選擇最適酶解底物濃度為10%。

圖5 不同底物濃度對(duì)葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of different substrate concentration on conversion rate of glucose and xylose

2.4 玉米芯不同發(fā)酵方式對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響

不同發(fā)酵方式對(duì)玉米芯糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化酒精的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，3種發(fā)酵方式之間酒精產(chǎn)量沒(méi)有顯著差別。70 h時(shí)，半同步發(fā)酵酒精產(chǎn)量要高于其他兩種方式，發(fā)酵時(shí)間達(dá)到80 h時(shí)，分步發(fā)酵酒精產(chǎn)量16.84 g/L，同步發(fā)酵和半同步發(fā)酵酒精產(chǎn)量相近，但都比分步發(fā)酵產(chǎn)量低0.6 g/L左右。原因是后兩種發(fā)酵方式酶解過(guò)程不徹底，發(fā)酵液中還存在未酶解的纖維素，葡萄糖含量少所以酒精產(chǎn)量稍低。王許濤等[24]使用稀酸預(yù)處理稻草，同步糖化發(fā)酵108 h，乙醇含量為11.16 g/L，酒精得率低于本研究結(jié)果，且其理論酒精轉(zhuǎn)化率僅為40%，明顯低于本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化率，這可能與預(yù)處理方法的選擇有直接關(guān)系。

表1 玉米芯不同方式發(fā)酵酒精產(chǎn)量Table 1 Alcohol yield of corn cob fermented in different ways

3 結(jié)論

堿法預(yù)處理玉米芯能有效提高酶解轉(zhuǎn)化率，50℃酶解時(shí)間24 h，在底物濃度為10%，纖維素酶添加量為20 mg/g，初始pH值為5.2時(shí)，玉米芯酶解葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到85%以上，木糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到80%以上。對(duì)預(yù)處理后的玉米芯30℃進(jìn)行糖化24h發(fā)酵80h，分步糖化發(fā)酵中，酒精產(chǎn)量為16.84g/L，為酒精轉(zhuǎn)化率理論值的61.9%；半同步糖化發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵酒精產(chǎn)量也分別達(dá)到了16.23 g/L和16.19 g/L，有效實(shí)現(xiàn)了利用玉米芯轉(zhuǎn)化酒精的目的，但熱水處理后發(fā)酵方式對(duì)酒精產(chǎn)量影響較低。