香梨發(fā)酵酒發(fā)酵工藝的優(yōu)化及其香氣成分研究

賈 娟，王婷婷，楊雯雯，王德良

（1.河南工業(yè)大學(xué) 漯河工學(xué)院，河南 漯河 462002；2.漯河職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 漯河 462002；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015）

果酒是以用水果為原料經(jīng)過破碎、壓榨取汁、發(fā)酵和調(diào)配等工藝釀造而成的低度飲料酒[1-2]。目前，果酒的品種逐漸增多（如菠蘿酒、獼猴桃酒、西瓜酒、草莓酒、火龍果等[3-7]），對各種果酒的探究引起了不少研究者的興趣。

梨在中國分布較廣，被營養(yǎng)學(xué)家譽為“功能食品”，其品種有很多，最具有代表性的是香梨。香梨味道濃郁、皮薄、肉細(xì)、汁多甜酥、清爽可口，系梨之上品；此外，香梨還具有調(diào)節(jié)人體新陳代謝、促進血液循環(huán)、保護心臟、減輕疲勞、增強心肌活力、降低血壓等多種功效[8]。河南省是梨果生產(chǎn)大省，主要的品種有酥梨、香梨、水晶梨、雪花梨、豐水梨等，品種多產(chǎn)量大，尤其是在豐收年，梨的價格低、銷售困難等因素。如果把梨加工成梨酒不僅能解決這一矛盾，而且能提高梨資源的利用率，拓寬果酒釀造的方向，具有較好的市場前景。

本試驗對河南平頂山香梨果酒生產(chǎn)工藝進行了研究，通過單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化確定最佳發(fā)酵工藝條件，采用頂空-固相微萃取（head-space solid phasemicroextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析[9-10]，對其香氣成分進行定量分析，為其精深加工和梨酒的品質(zhì)鑒定提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香梨：河南平頂山；果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖（食品級）：漯河市農(nóng)貿(mào)市場；異抗壞血酸鈉：鄭州拓洋實業(yè)有限公司；偏重亞硫酸鉀：意大利拉曼公司；檸檬酸：濰坊美軒實業(yè)有限公司；EX-V果膠酶（10萬U/g）：曼森商貿(mào)有限公司；NaOH（分析純）：上海禹泰化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCION SQ 456氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國布魯克·道爾頓公司；手動固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）裝置（15mLSPME，100μm聚二甲基硅烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取頭，手柄）；HR1871Philips Avance系列榨汁機：飛利浦電子香港有限公司；SHHW21.600A（I）電熱恒溫水溫箱：廣州市典銳化玻實驗儀器有限公司；XSE105DU電子稱：深圳市盛美儀儀器有限公司；LHP-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；WYT型手持式糖量計折射儀：北京紫金光儀器有限公司；PHS-2C型酸度計：上海智光儀器儀表有限公司；721型分光光度計：上海天普儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香梨果酒工藝流程及操作要點

選擇新鮮成熟的香梨，清水洗凈后去皮、去核、切塊、榨汁，過濾可得澄清梨果原汁。在梨果原汁加入（按梨汁質(zhì)量）焦亞硫酸鉀0.03%、異抗壞血酸鈉0.07%和檸檬酸0.03%溶液進行護色[11]。護色后的梨汁加入3‰果膠酶混勻，酶解溫度40℃，時間為5 h。用8層紗布過濾，得到梨汁備用。添加蔗糖調(diào)整梨汁糖度為19%，添加檸檬酸調(diào)整梨汁初始pH值。稱取20 g酵母，加入5%糖水無菌水稀釋至100 mL，37～38℃攪拌活化15～20 min得0.2 g/mL酵母活化液。將梨汁倒入容器內(nèi)，裝液量80%，加入一定量的活化酵母，攪拌均勻后，在一定溫度條件下進行酒精發(fā)酵，每天攪拌1～2次，發(fā)酵7 d，用120目濾布過濾得梨酒。最后將梨酒進行澄清后進行巴氏殺菌（65℃、30 min）。

1.3.2 香梨果酒發(fā)酵條件的單因素試驗設(shè)計

初始pH值：分別調(diào)整梨汁初始pH值為3.0、3.2、3.4、3.6、4.0，在酵母添加量為0.3%的條件下，26℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，發(fā)酵7 d后，以酒精度和感官評定來確定最適初始pH值。

酵母接種量：調(diào)整梨汁初始pH值為3.5，分別將酵母添加量調(diào)整為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，發(fā)酵7 d后，以酒精度和感官評定來確定最適酵母接種量。

發(fā)酵溫度：調(diào)整梨汁初始pH值為3.5，將酵母添加量調(diào)整為0.3%，分別在發(fā)酵溫度為16℃、19℃、22℃、25℃、28℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，發(fā)酵7 d后，以酒精度、和感官評定來確定最佳發(fā)酵時間。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，以初始pH值、酵母接種量、發(fā)酵溫度為考察因素，以梨酒酒精度（Y）為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0.6軟件進行3因素3水平的響應(yīng)面分析[12]，建立數(shù)學(xué)模型，以獲得梨酒最佳制作工藝條件，試驗因素水平編碼如表1所示。

表1 香梨酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of fragrant pear wine

1.3.4 測定方法[13-14]

酒精度測定：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；糖度測定：采用手持測糖儀測定；pH測定：采用酸度計測定；微生物檢測按《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗標(biāo)準(zhǔn)》（GB/T 4789—2008）的相應(yīng)方法執(zhí)行。

產(chǎn)品的綜合評價：隨機選定具有一定代表性的學(xué)生20名，逐一品嘗各配方組合，并分別進行評分，再統(tǒng)計每個組合的果酒品質(zhì)綜合評定。感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 香梨果酒感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of fragrant pear wine

香梨果酒香氣成分的GC-MS分析：按照參考文獻[14]的方法進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 香梨果酒生產(chǎn)工藝的單因素試驗

2.1.1 初始pH值的確定

發(fā)酵液的酸堿程度對酵母的生長和代謝產(chǎn)物的形成具有一定得影響。不同的酵母都有其最適合的生長范圍。過高或過低都會抑制酵母體內(nèi)酶的活性，使得酵母細(xì)胞的代謝受到阻礙，從而影響酒精的產(chǎn)量[15]。

圖1 初始pH值對香梨果酒酒精度和感官評分的影響Fig.1 Effect of initial pH on alcohol content and sensory score of fragrant pear wine

由圖1可知，隨著初始pH值的升高，酒精度及感官評分均呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)初始pH值為3.4時，酒精度及感官評分均達到最高，主要原因是初始pH值過低時，酵母產(chǎn)生酒精的量較少，發(fā)酵原液的糖類沒有轉(zhuǎn)換成酒精，當(dāng)pH＞3.6時，發(fā)酵酒的口感粗糙，味道略微帶酸，因此選擇梨汁初始pH值為3.4較好。

2.1.2 酵母接種量的確定

接種量與發(fā)酵周期有直接關(guān)系。酵母接種量對香梨果酒酒精度和感官評分影響見圖2。

圖2 酵母添加量對香梨果酒酒精度和感官評分的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory score of fragrant pear wine

由圖2可知，隨著酵母接種量的增加，酒精度及感官評分均呈先增加后降低的趨勢。當(dāng)接種量為0.3%時，香梨果酒的酒精度及感官評分均達到最高。這主要是酒精的產(chǎn)出量隨酵母接種量的增加而增大，當(dāng)酵母添加量過低時，則發(fā)酵慢，料液中的糖不能完全被酵母利用，產(chǎn)生酒精度低[16]；接種量過大時，酵母相互之間抑制生長，導(dǎo)致酒精量減少，也易產(chǎn)生酵母異味[17]。因此選擇酵母接種量為0.3%較好。

2.1.3 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對梨酒酵母菌的生長有很大的影響，酵母接種量對香梨果酒酒精度和感官評分影響見圖3。由圖3可知，隨著溫度的升高，酒精度及感官評分均呈先增加后降低的趨勢。溫度升高時，發(fā)酵速度加快；如溫度過高，酵母菌生長速度較快，容易衰老，不能在發(fā)酵后期將發(fā)酵液中的糖有效轉(zhuǎn)化成酒精[18]，會影響產(chǎn)酒精量，而且酒體粗糙，酒質(zhì)容易氧化，感官評分也隨著溫度的升高而有所下降。當(dāng)發(fā)酵溫度為25℃時，酒精度和感官評分都達到最高。KILLIAN E等[19]的研究結(jié)果也認(rèn)為，較低的發(fā)酵溫度有利于改善果酒的質(zhì)量，這主要是因為發(fā)酵溫度升高會使果香揮發(fā)、氧化損失加大，還會引起高級醇、揮發(fā)酸、醛類等副產(chǎn)物的增加，使酒的風(fēng)味劣變綜合考慮，因此選擇發(fā)酵溫度為25℃較好。

圖3 發(fā)酵溫度對香梨果酒酒精度和感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory score of fragrant pear wine

2.2 香梨果酒發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗

利用Design-expert8.0.6軟件對表3進行數(shù)據(jù)分析，得到感官評分Y與自變量X1、X2、X3的二次回歸方程為Y=94.20+2.48X1-0.89X2+2.31X3-0.075X1X2+0.22X1X3-0.65X2X3-8.25X12-2.38X22-5.62X32

對以上響應(yīng)面回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表4，建立的數(shù)學(xué)模型，回歸模型F=77.55，P＜0.000 1表明香梨果酒的酒精度評分與3個因素之間的回歸方程極顯著。因變量與所考察自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.990 1），調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.977 3，說明可解釋97.73%相應(yīng)值得變化，模型失擬項0.167 9＞0.05，不顯著，擬合程度好，表示單因素試驗結(jié)果可以和數(shù)學(xué)模型模擬良好。表4中的一次項X1、X3及二次項X12、X22、X32的值均＜0.01，達到極為顯著水平，說明它們對響應(yīng)值影響極大，且考察的因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。由F值大小可知，影響因素的主次順序是：X3＞X1＞X2。

表3 香梨果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of response surface tests for fermentation process optimization of fragrant pear wine

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

3個因素交互作用對香梨果酒感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線見圖4。由圖4可知，在試驗所選擇的水平范圍內(nèi)，因素之間交互作用對香梨果酒的感官評分的影響相似，都隨著各交互因素添加量的增加達到最大值后又降低，X1X2、X1X3、X2X3之間有一定交互作用，但是其交互用對感官評分影響相對較小。

圖4 初始pH值、發(fā)酵溫度及酵母添加量間交互作用對香梨果酒感官評分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH,fermentation temperature and yeast inoculum on sensory score of fragrant pear wine

2.3 回歸模型的驗證試驗

為了驗證響應(yīng)面預(yù)測得出的最佳工藝參數(shù)，按照初始pH值、酵母添加量、發(fā)酵溫度分別為3.5，0.3%，25.2℃，進行3次平行驗證試驗，最終感官評分的平均值為94.4分，與預(yù)測值94.7較接近，在此條件下測定的酒精度為10.5%vol。說明該模型能很好地預(yù)測香梨果酒發(fā)酵條件與感官評分的關(guān)系。

2.4 香梨果酒發(fā)酵工藝風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果

按照本釀造工藝所得到的香梨果酒香氣成分通過GC-MS分析，詳細(xì)的鑒定結(jié)果見表5。

表5 香梨果酒香氣成分的GC-MS鑒定結(jié)果Table 5 Identification results of aroma components in fragrant pear wine by GC-MS

續(xù)表

通過GC-MS分析得出，共鑒定出68種香梨果酒的香氣成分，占總香氣成分的99.547%。從表1可以看出，香梨果酒香氣物質(zhì)主要包括酯類24種、醇類10種、醛類8種、酸類8種、酮類5種、萜烯類2種、烷烴類2種，酚類1種和6種其他類化合物。其中酯類物質(zhì)占香氣成分的48.395%；醇類物質(zhì)占香氣成分的31.569%；醛類占香氣成分的2.187%；酸類占香氣成分的4.904%；萜烯類占香氣成分的3.124%。

鑒定出的酯類化合物共有24種，是含量最多的香氣成分，對香梨果酒的獨特風(fēng)味有重要的影響。一般認(rèn)為酯類化合物形成途徑是酵母的生物合成。其中檢測出的乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯和乙酸異戊酯含量都較高，其分別代表較強的酒香氣味；桔子或葡萄香味[20]；類似水果香味的香味；蘋果、櫻桃的水果香氣；香蕉、草莓果香[21]；香蕉香、甜香、蘋果香、水果糖香[22]，酯類化合物主要賦予果酒怡人的果香氣，可以使酒體變得果香濃郁、酒香醇和香氣協(xié)調(diào)。鑒定出的醇類化合物共有10種，醇類物質(zhì)含量僅次于酯類揮發(fā)性風(fēng)味化合物，在不同風(fēng)味成分轉(zhuǎn)化中有重要作用，對香梨果酒的風(fēng)味形成有重要的貢獻[23]。果酒中的醇類化合物有異戊醇、正己醇、2,3-丁二醇、苯乙醇等化合物，它們分別代表水果香、花香[20]；青草味[20]；酒香[21]花香、水果香、甜香[20]。這些醇類物質(zhì)是由原料中的蛋白質(zhì)和糖類通過酵母的發(fā)酵作用，降解成的各種醇類化合物。研究表明[24]，少量的高級醇是果酒重要的風(fēng)味物質(zhì)，適量的高級醇賦予酒體優(yōu)雅的香氣的感官特性，同時這些物質(zhì)又是其他香氣物質(zhì)的良好溶劑，它們的嗅覺一般都很低，所以香氣值很高，對總體香氣的形成有不可忽視的作用。

鑒定出酸類化合物8種，主要是對香梨果酒的口感和后味，但其閾值較高，對果酒的香氣貢獻起到助香、減少刺激和緩沖平衡的輔助作用[25]。分別鑒定出醛類、酮類8種和5種，這些成分對果酒品質(zhì)有重要貢獻[26-27]，另外在香梨果酒中鑒定出萜烯類物質(zhì)如萜品油烯和α-法尼烯，其中α-法尼烯是一類具有較強香氣和生理活性的天然化合物[28]。研究表明該類物質(zhì)也能對梨酒果酒的清香起到一定作用。

3 結(jié)論

本研究通過單因素及響應(yīng)面試驗得到香梨果酒的最佳發(fā)酵條件為初始pH值3.5、酵母添加量0.3%、發(fā)酵溫度25.2℃，在此條件下，香梨果酒的感官評分為94.4分，酒精度為10.5%vol。香梨果酒呈現(xiàn)淡金黃，澄清透明，均勻一致；酒體舒適并有香梨味柔和；醇香濃郁、性質(zhì)穩(wěn)定。從香梨果酒中共鑒定出香氣物質(zhì)68種，占總香氣成分的99.547%，其中相對含量較高的香氣物質(zhì)為乳酸乙酯11.938%、乙酸異戊酯1.167%、己酸乙酯4.414%、乙酸己酯2.092%、辛酸乙酯11.754%、丁酸乙酯9.039%、異戊醇12.689%、正己醇4.299%、2,3-丁二醇6.005%、苯乙醇3.357%、苯甲醛2.008%。綜合評價出平頂山香梨酒中的特征香氣物質(zhì)，為河南平頂山香梨酒提供理論依據(jù)。