有機(jī)氮源對L-色氨酸發(fā)酵的影響

杜麗紅，張 震，徐慶陽*，陳 寧，尚永崇

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

L-色氨酸屬于芳香族氨基酸，是8種必需氨基酸之一[1]。因色氨酸對人和動(dòng)物的生長發(fā)育、新陳代謝起著重要作用，已被廣泛用于醫(yī)藥、食品與飼料等行業(yè)[2-5]。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)色氨酸得到全面推廣[6-7]。微生物發(fā)酵法具有原料價(jià)格低廉、工藝控制簡單、產(chǎn)品質(zhì)量可靠等優(yōu)點(diǎn)[8]。直接發(fā)酵法生產(chǎn)色氨酸離不開高產(chǎn)色氨酸的微生物菌株，但色氨酸合成途徑復(fù)雜且受多種調(diào)控機(jī)制的調(diào)節(jié)[9-10]，生產(chǎn)水平較低，很難在短時(shí)間內(nèi)有較大突破，而發(fā)酵條件優(yōu)化也逐漸受到人們關(guān)注，找到菌株的最適培養(yǎng)條件可發(fā)揮菌株的最大潛能。但隨著發(fā)酵工業(yè)的快速發(fā)展，發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和發(fā)酵調(diào)控的合理性提出了更高的要求[11]。優(yōu)良的L-色氨酸生產(chǎn)菌株、合理的培養(yǎng)基組成和適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵調(diào)控策略有利于提高L-色氨酸的產(chǎn)酸水平[12]。在培養(yǎng)基成分中，以富含各種氨基酸及其他營養(yǎng)物質(zhì)的酵母粉作為氮源，被廣泛應(yīng)用于色氨酸的生產(chǎn)，黃靜等[13]通過對多種有機(jī)氮源進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，確定了酵母粉為最適大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸的最佳氮源，但是酵母粉也含有一些蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，容易造成產(chǎn)酸波動(dòng)[14-15]，從種類繁多的酵母粉中選擇出最適菌株的工作也很重要；氨基酸粉更多的是作為飼料添加劑使用，作為氮源應(yīng)用于微生物發(fā)酵的研究還在起步階段[16-17]，應(yīng)用于色氨酸發(fā)酵的研究還鮮見報(bào)道；氯化膽堿則可為細(xì)胞提供不穩(wěn)定甲基，促進(jìn)細(xì)胞生長代謝[18-19]應(yīng)用于異亮氨酸發(fā)酵時(shí)[20]，不僅可提高產(chǎn)量，亦可提高糖酸轉(zhuǎn)化率。

本實(shí)驗(yàn)選擇不同的有機(jī)氮源進(jìn)行組合，并對其添加時(shí)間或添加量進(jìn)行了研究，以期解決色氨酸發(fā)酵過程中遇到的各種問題。為提高大腸桿菌（Escherichia coli）TRP03積累色氨酸的能力，對酵母粉的種類進(jìn)行了最優(yōu)選擇；為避免菌株因氮源切換（速效氮源被利用完畢，細(xì)胞開始分解有機(jī)氮源進(jìn)行利用）而出現(xiàn)的細(xì)胞生長停滯期，嘗試在培養(yǎng)基中添加氨基酸粉和氯化膽堿；為解決菌體早衰，提高中后期菌體活力，選擇添加酵母粉、蛋氨酸和谷氨酰胺，并對添加時(shí)間進(jìn)行了摸索，希望提高后期細(xì)胞產(chǎn)酸能力，進(jìn)一步提高色氨酸產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）TRP03：天津科技大學(xué)代謝工程研究室。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 2.5 g/L，瓊脂25 g/L，pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉6 g/L，（NH4）2SO41 g/L，KH2PO4g/L，檸檬酸0.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.8mg/L，維生素B1（vitamin B1，VB1）0.2mg/L，生物素 1 mg/L，MnSO4·H2O 1.2 mg/L，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉3 g/L，（NH4）2SO41 g/L，KH2PO44 g/L，檸檬酸2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，VB11.5 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 30 mg/L，生物素1 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，pH 7.0～7.2。

上述培養(yǎng)基均在115℃滅菌15 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖：西王藥業(yè)有限公司鄒平分公司；（NH4）2SO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaOH：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；檸檬酸、MnSO4·H2O：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨基酸粉、蛋氨酸：上海阿拉丁生物科技有限公司；氯化膽堿：上海瑞永生物科技有限公司；酵母粉[Springer 0805（總氮11.3%總氨基酸58.0%）、Springer 0820（總氮11.8%總氨基酸61.4%）、Springer 2006（總氮10.3%總氨基酸41.36%）、Springer0203（總氮10.6%總氨基酸52.3%）、Springer 1203（總氮11.0% 總氨基酸54.3%）、NucelR889PA（總氮11.5%總氨基酸60.1%）、Springer 0835（總氮11.5%總氨基酸59.5%）、Springer LP0021（總氮10.0%～12.5%總氨基酸52%～62%）]：法國BioSpringer有限公司；LP0021酵母提取物：英國OXOID公司；氨基酸粉：山東恩沐生物有限公司；實(shí)驗(yàn)室所用化學(xué)試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250-A生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；5 L離位滅菌發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；V-1200型可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；SBA-40E生物傳感儀：山東省科學(xué)院研究所；UltiMate 3000高效液相色譜儀：美國Thermo Scientific公司；TCDA 161485活細(xì)胞在線檢測儀：英國ABER公司；MQD-A3R高精度三層疊加式振蕩培養(yǎng)箱：上海旻泉儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

位于北京市海淀區(qū)上莊鎮(zhèn)白水洼路附近的有機(jī)蔬果園，自2002年創(chuàng)辦至今，占地面積已達(dá)300畝。園內(nèi)擁有11個(gè)日光溫室，最多時(shí)每天可產(chǎn)出蔬果幾十種，取名良之悅品。

菌株活化：于甘油管中取一環(huán)菌液涂布于一代斜面培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h，于一代斜面培養(yǎng)基中取一環(huán)菌體活化于二代斜面培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h。

菌懸液制備：將200 mL去離子水裝于500 mL圓底燒瓶，121℃滅菌20 min，在無菌間將滅菌的去離子水倒入已活化好菌體的斜面培養(yǎng)基中，接種環(huán)將全部菌體輕輕刮起，再倒入圓底燒瓶中。

搖瓶培養(yǎng)方法：取一環(huán)菌體置于斜面培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12 h，將活化好的菌株轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，裝液量為30 mL/250 mL，200 r/min、37℃搖床振蕩培養(yǎng)12 h，然后按10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃、200 r/min培養(yǎng)發(fā)酵24 h，測定發(fā)酵液中目的產(chǎn)物L(fēng)-色氨酸含量。發(fā)酵過程中，苯酚紅為pH指示劑，控制pH值為7.0～7.2左右。

5 L離位滅菌發(fā)酵罐培養(yǎng)方法：種子培養(yǎng)基與搖瓶振蕩培養(yǎng)基成分相同，取適量無菌水于斜面培養(yǎng)基中，用接種環(huán)將菌體輕輕刮起制成菌懸液，接入種子培養(yǎng)基中，控制pH值為7.0左右，發(fā)酵溫度37℃，溶氧25%～35%，待細(xì)胞OD600nm值達(dá)到10～12。按15%～20%接種量接入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中通過流加氨水（NH4OH）來控制pH 7.0左右，發(fā)酵溫度37℃，溶氧25%～35%之間；當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗完之后，流加800 g/L葡萄糖溶液，保證發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度在0.1～5.0 g/L；發(fā)酵周期36 h。

1.3.2 測定方法

生物量的測定：通過生物傳感儀測量波長600 nm處的吸光度值（OD600nm）來監(jiān)測細(xì)胞的生長；葡萄糖含量測定：通過生物傳感儀實(shí)時(shí)測定發(fā)酵液中的葡萄糖濃度；活細(xì)胞檢測：使用活細(xì)胞在線檢測儀。

L-色氨酸測定：采用高效液相色譜法，其色譜條件為：采用Gemini C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為體積比2∶98的乙腈-水混合液，流速控制在1 mL/min，檢測波長278 nm，溫度為40℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母粉對L-色氨酸生產(chǎn)的影響

為提高菌株TRP03生產(chǎn)色氨酸的能力，選擇了8種不同的酵母粉，分別是Springer 0805、Springer 0820、Springer 2006、Springer 0203、Springer 1203、Nucel R 889PA、Springer 0835和LP0021酵母提取物進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)定3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室常用的酵母粉為LP0021酵母提取物，將此組作為對照組。搖瓶發(fā)酵24 h后，對菌體OD600nm值和L-色氨酸積累進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同氮源對菌體生長（A）和L-色氨酸產(chǎn)量（B）的影響Fig.1 Effects of different nitrogen sources on cell growth(A)andL-tryptophan production(B)

由圖1可知，8組實(shí)驗(yàn)中，第2組耗氨、耗糖速率最快，綜合兩項(xiàng)指標(biāo)來看，其余6組均與對照組無太大差異，說明相應(yīng)氮源效果與對照組相當(dāng)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，第2組OD600nm值為29.8，比對照組高8.31%，色氨酸平均產(chǎn)量為10.25 g/L，比對照組高25.77%，并且兩個(gè)指標(biāo)均為第8組中最高，同時(shí)氮源Springer 0820中，總含氮量為11.8%，與其他酵母粉相差不大，但是總氨基酸含量61.4%，明顯高于其他酵母粉含量，因此，Springer 0820酵母粉更容易被菌體吸收利用，有利于菌體生長和產(chǎn)酸，適合被用作E.coli TRP03的發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。

2.2 氨基酸粉和氯化膽堿的添加對L-色氨酸生產(chǎn)的影響

上述搖瓶實(shí)驗(yàn)中，確定了最佳酵母粉為Springer 0820后，進(jìn)行了5 L發(fā)酵罐發(fā)酵性能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在菌體發(fā)酵前期，溶氧緩慢回升，應(yīng)該是速效氮源被細(xì)胞利用完畢，遲效氮源沒有及時(shí)被細(xì)胞分解利用，細(xì)胞生長受到影響，同時(shí)在該階段中細(xì)胞生產(chǎn)色氨酸的能力也隨之下降。為解決該問題，選擇在培養(yǎng)基中添加富含各種氨基酸能快速被細(xì)胞利用的氨基酸粉和可作甲基供體的氯化膽堿，分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L的氨基酸粉，同時(shí)以不添加氨基酸粉的發(fā)酵菌株為對照組，發(fā)酵過程中菌體生長情況和L-色氨酸產(chǎn)量結(jié)果見圖2；分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.2 g/L、0.5 g/L、0.8 g/L的氯化膽堿，同時(shí)以未添加氯化膽堿組為對照組，發(fā)酵過程中菌體生長情況和L-色氨酸產(chǎn)量結(jié)果見圖3；同時(shí)添加氨基酸粉和氯化膽堿，配比分別為氨基酸粉1.5g/L和氯化膽堿0.5 g/L，氨基酸粉2.0 g/L和氯化膽堿0.5 g/L，氨基酸粉2.0 g/L和氯化膽堿0.2 g/L，同時(shí)以不添加氨基酸粉和氯化膽堿組為對照組，菌體生長情況和L-色氨酸積累見圖4。

圖2 不同氨基酸粉添加量對菌體生長（A）和L-色氨酸產(chǎn)量（B）的影響Fig.2 Effects of different addition of amino acid powder on cell growth(A)and L-tryptophan production(B)

由圖2A和2B可知，在1.5～3.0h時(shí)，對照組在該階段的細(xì)胞生長幾乎處于停滯狀態(tài)，L-色氨酸積累速率為0.289g/（L·h）；當(dāng)氨基酸粉添加量在1.5 g/L時(shí)，細(xì)胞生長仍較緩慢，趨勢與不添加氨基酸粉基本相同，說明該階段的細(xì)胞二次生長現(xiàn)象沒有得到緩解；當(dāng)氨基酸粉添加量為2 g/L時(shí)，細(xì)胞生長速率得到明顯緩解，2.5 h后，細(xì)胞進(jìn)入正常生長狀態(tài)，同時(shí)，L-色氨酸生產(chǎn)速率為0.428 8 g/（L·h），較對照組提高近50%，但是在1.5～2.5 h，細(xì)胞生長仍較緩慢，表明氨基酸粉添加為2 g/L時(shí)，不能完全避免因氮源替換帶來的二次生長現(xiàn)象；當(dāng)氨基酸粉添加量為2.5 g/L時(shí)，產(chǎn)L-色氨酸速率為0.397 8 g/（L·h），說明氨基酸粉添加量＞2 g/L后，沒有繼續(xù)提升L-色氨酸產(chǎn)量。結(jié)果表明，氨基酸粉最佳添加量為2 g/L，很大程度上解決了細(xì)胞生長遲緩的情況。同時(shí)，縱觀整個(gè)發(fā)酵過程，氨基酸粉的添加一定程度上加速了細(xì)胞的生長，當(dāng)添加量＜2 g/L時(shí)，雖然細(xì)胞生長加快，但同時(shí)菌體衰亡也較對照組提前了1～2 h，當(dāng)添加量提高至≥2 g/L時(shí)，細(xì)胞衰亡提前了3～4 h，但是L-色氨酸最終產(chǎn)量為39.12 g/L，較對照組提高了8.28%。

圖3 不同氯化膽堿添加量對菌體生長（A）和L-色氨酸產(chǎn)量（B）的影響Fig.3 Effects of different addition of choline chloride on cell growth(A)and L-tryptophan production(B)

由圖3A和3B可知，在發(fā)酵1.5～3.0 h內(nèi)，氯化膽堿添加量為0.2 g/L時(shí)，細(xì)胞生長仍較緩慢；當(dāng)氯化膽堿添加量提升至0.5 g/L時(shí)，細(xì)胞生長情況得到明顯改善，2 h后細(xì)胞進(jìn)入快速生長階段，隨著細(xì)胞快速生長，L-色氨酸積累速率也得到快遞提升，但是1.5～2 h，細(xì)胞仍處于生長停滯狀態(tài)；當(dāng)氯化膽堿添加量繼續(xù)提升至0.8 g/L時(shí)，細(xì)胞生長狀態(tài)沒有進(jìn)一步得到改善，二次生長現(xiàn)象沒有完全消除。在整個(gè)發(fā)酵過程中，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長速度較對照組均不同程度加快，但是也使得細(xì)胞衰亡有不同程度提前，此外，L-色氨酸積累得到提升，但是添加量＞0.5 g/L之后，L-色氨酸生產(chǎn)會(huì)明顯低于添加量為0.5 g/L的實(shí)驗(yàn)組。

由圖4A和4B可知，在發(fā)酵時(shí)間1.5～3.0 h，添加配比為氨基酸粉1.5 g/L、氯化膽堿0.5 g/L和氨基酸粉2.0 g/L、氯化膽堿0.2 g/L時(shí)，很大程度上提高了細(xì)胞生長速率，細(xì)胞停滯生長時(shí)間縮小為0.5 h，L-色氨酸積累也得到提高；當(dāng)添加配比為氨基酸粉2.0 g/L和氯化膽堿0.5 g/L時(shí)，細(xì)胞處于持續(xù)生長狀態(tài)，細(xì)胞停滯生長階段得到完全解除，同時(shí)色氨酸持續(xù)積累，積累速率較對照組提高了4倍左右，因此，確定氨基酸粉2.0 g/L和氯化膽堿0.5 g/L為最佳添加配比。在整個(gè)發(fā)酵過程中，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組在4 h進(jìn)入了快速生長階段，較對照組提前了2h，最佳配比下，最高菌體量（OD600nm值）可達(dá)92，較對照組提高了13.88%，L-色氨酸最終積累44.21g/L，較對照組提高22.22%，較其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組提高12.82%，但是，在20 h后，細(xì)胞不再繼續(xù)生長，產(chǎn)酸速率緩慢降低。

圖4 不同組合的氨基酸粉和氯化膽堿的添加對菌體生長（A）和L-色氨酸產(chǎn)量（B）的影響Fig.4 Effects of different combinations of amino acid powder and choline chloride on cell growth(A)and L-tryptophan production(B)

氨基酸粉和氯化膽堿二者的單獨(dú)添加均可在一定水平上解決細(xì)胞二次生長的問題，而同時(shí)添加則可以完全避免二次生長，結(jié)果符合預(yù)期。

2.3 酵母粉、蛋氨酸和谷氨酰胺的流加對L-色氨酸發(fā)酵的影響

為緩解細(xì)胞衰亡，菌體活力降低和產(chǎn)酸速率下降等現(xiàn)象，選擇在發(fā)酵不同時(shí)期流加酵母粉、蛋氨酸和谷氨酰胺（質(zhì)量濃度均為1 g/L）混合液，蛋氨酸為胞內(nèi)重要的甲基供體，谷氨酰胺則為色氨酸合成的前體物之一，通過流加混合液，及時(shí)滿足胞內(nèi)各種反應(yīng)所需的氨基酸、甲基及色氨酸合成所需的前體，希望在解決菌體活力下降問題的同時(shí)，進(jìn)一步提高L-色氨酸產(chǎn)量。混合液的流加時(shí)間選擇發(fā)酵6h、10h、14h，流加方式選擇隨糖流加，流加速率為0.01g/L，流加至20 h停止流加。并以不流加酵母粉、蛋氨酸和谷氨酰胺菌株（解除二次生長現(xiàn)象的菌株）為對照組，對細(xì)胞生長、色氨酸產(chǎn)量、活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖5。

圖5 不同時(shí)期的酵母粉、蛋氨酸和谷氨酰胺添加對菌體生長（A）、L-色氨酸產(chǎn)量（B）和活細(xì)胞數(shù)（C）的影響Fig.5 Effects of yeast powder,methionine and glutamine addition at different stages on cell growth(A),L-tryptophan production(B)and viable cell count(C)

由圖5可知，在6 h補(bǔ)加混合營養(yǎng)物時(shí)，發(fā)酵前期，菌體生長和L-色氨酸積累有微量提高，菌體衰亡延遲了2 h，L-色氨酸產(chǎn)量在46 g/L左右，22 h后，活細(xì)胞數(shù)雖然在下降，但是較對照組有了明顯改善；在14 h添加混合營養(yǎng)物時(shí)，菌體衰亡得到進(jìn)一步改善，因活細(xì)胞數(shù)的增加，L-色氨酸產(chǎn)量得到進(jìn)一步提高，達(dá)48 g/L，較對照組提高了9.09%；添加時(shí)間為10h時(shí)，在發(fā)酵20h后，雖然菌體量沒有進(jìn)一步生長，但是趨于平穩(wěn)狀態(tài)，活細(xì)胞數(shù)也得到穩(wěn)定，最終活細(xì)胞數(shù)較對照組提高了30.18%，較其他兩組提高了近8.85%，在菌體活力得到改善的條件下，L-色氨酸最終可積累51.23 g/L，較對照菌株提高了16.43%，較14 h添加混合營養(yǎng)物時(shí)的L-色氨酸積累量提高了6.73%。

3 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化有機(jī)氮源、不同時(shí)期添加不同營養(yǎng)物質(zhì)逐步改善了細(xì)胞生長狀態(tài)，L-色氨酸積累得到提升。選擇Springer 0820為氮源時(shí)，菌株生長和L-色氨酸產(chǎn)量均得到提升，利用5 L生物反應(yīng)器進(jìn)行發(fā)酵，在培養(yǎng)基中同時(shí)添加氨基酸粉2.0 g/L，氯化膽堿0.5g/L時(shí)，可完全解除細(xì)胞因氮源切換造成的停滯期，同時(shí)最終L-色氨酸可積累44.21g/L，較對照組提高20.85%，在發(fā)酵10 h流加酵母粉、蛋氨酸和谷氨酰胺，明顯改善了細(xì)胞的衰亡問題，24 h后，電容值持續(xù)穩(wěn)定在14 pF，意味著活細(xì)胞數(shù)沒有出現(xiàn)明顯下降趨勢，同時(shí)L-色氨酸生產(chǎn)速率維持在1.15 g/（L·h），最終L-色氨酸產(chǎn)量在51.23 g/L，較未經(jīng)任何優(yōu)化的菌株提高41.91%。